Introduction
Tykktarmskreft (CRC) er den 4. vanligste årsaken til kreft på verdensbasis en. Til tross for betydelig fremgang i vår forståelse av familiær bakgrunn av denne sykdommen, bidrar genetisk predisposisjon bare til ~ 20% av CRC tilfeller 2. Resten er knyttet til en rekke ytre og miljøfaktorer, inkludert kronisk betennelse. Hos mennesker, koblingen mellom kronisk betennelse og kreft i tykktarmen er tydelig i ulcerøs kolitt (UC) pasienter, som har en større risiko for å utvikle kolitt-assosiert kreft i tykktarmen (CAC), avhengig av varigheten, omfanget og alvorlighetsgraden av den inflammatoriske sykdommer 3 -5. Følgelig nye terapier er under utvikling for å styre immunresponsen og tilhørende produksjon av vekstaktiverende faktorer ved den inflammatoriske tumormikro 6-8. Det er et økende krav til egnede pre-kliniske dyremodeller for å karakterisere den terapeutiske effekt avDisse medikamenter mot utvikling og progresjon av sykdommen.
Musemodeller har entydig vist at den inflammatoriske mikro bidrar til CRC progresjon, selv ved fravær av åpenbar inflammasjon 9,10. Disse modellene omfatter bruk av polysakkaridet dekstran-sulfat-natrium (DSS), anordnet i drikkevannet til mus, for å modellere epitelial skade og akutt og kronisk inflammatorisk tarmsykdom (IBD) 11,12. Selv om mekanismen ved hvilken DSS induserer slimhinneskade og kolitt ikke er helt forstått, noen studier antyder at DSS hemmer cellulære revers transkriptase og ribonuklease-aktivitet i cellene, eller fremmer dannelsen av nano-lipid-komplekser som blandes med colonic membranen fører til epitelskade 13,14. Modifikasjoner på standard DSS modellen har også gitt betydelig innsikt i de mekanismer som colonic epitelceller opprettholde vev homeostase og bestemmelser ogsent slimhinneimmunresponser 15.
Intraperitoneal administrering av Azoxymethane (AOM) alene, eller i kombinasjon med DSS, gir en modell for å undersøke samspillet mellom somatiske mutasjoner i epithelial slimhinne og den inflammatoriske og stromal mikro 16,17. AOM er en metabolitt av kreftfremkallende 1,2-dimetylhydrazin (DMH) som ikke direkte føre til DNA mutasjoner. I stedet er AOM hydrolysert til methylazoxymethanol (MAM) av cytokrom-isoformen CYP2E1 i leveren, hvor MAM er konjugert med glukuronsyre og deretter transporteres til tarmen gjennom galle sekreter 18. Det er antatt at den bakterielle β-glukuronidase bidrar til nedbrytning av MAM som resulterer i DNA-alkylering og akkumulering av mutasjoner i epitelceller 19. De fleste AOM-indusert colonic svulster havn missense mutasjoner i genet som koder for β-catenin, rendering protein motstandsdyktig mot proteasomal degradatipå, noe som resulterer i unormal aktivering av den kanoniske Wnt-signalveien 20. Når aktiviteten av AOM er kombinert med slimhinneskade fremkalt ved DSS, skaper den påfølgende sårheling respons et mikromiljø som fremmer veksten og ekspansjonen av de mutageniserte epitel. I en variasjon av denne modellen, kan repeterende administrering av AOM alene over en periode på flere uker anvendes for å modellere sporadisk kolorektal cancer, i fravær av DSS-indusert kolitt 10,17. Disse to gratis modellene gir eksperimentelle innstillinger for å studere CAC og sporadisk CRC henholdsvis, som begge er knyttet til en pro-inflammatorisk svulstens mikro 10.
Bruken av serieendoskopi i mus ble utviklet av Becker og kolleger 21, og gjør det mulig for langsgående overvåking av kolitt og tumorprogresjon. Her gir vi tre pre-kliniske protokoller basert på DSS-indusert slimhinneskader og / eller AOM-mediert tumor induksjon til reproduserbart indusere spesifikke colonic patologi. Den første protokollen beskriver indusere akutt slimhinneskader i respons til DSS administrasjonen å lokke fram mange av de histopatologiske funksjoner tilknyttet IBD. Den andre protokollen er basert på tre på hverandre følgende sykluser med DSS administrasjon for å etterligne de fakler av inflammasjon som vanligvis observeres i IBD-pasienter, og kan utføres i forbindelse med AOM-induserte mutasjoner. Den endelige protokollen er basert på AOM-induserte epitel-sporadiske mutasjoner. For hver av disse protokollene, vi se nærmere på de relevante standard fremgangsmåter for å inkludere profylaktisk og terapeutisk intervensjon metoder som er utviklet for å overvåke effekten av nye legemidler.
Protocol
Walter og Eliza Hall Institute of Medical Research dyreetikk komité godkjente hver av prosedyrene som er beskrevet i disse protokollene.
1. Utarbeidelse av Experimental Mus
- Komponere eksperimentelle kohorter av minst fire kjønn matchet 6-8 uker gamle C57BL / 6 mus (M. musculus) som er avlet og plassert i samme spesifikke patogen fri (SPF) Dyreavdelingen / rom og følger med Autoclaved mat og vann. Bruken av hunnmus vil tillate co-bolig av mus fra forskjellige linjer, grense boksen tall, og redusere bur til bur variasjon.
- Sikre at mus er minst seks ukers alder for å aktivere endoskopi prosedyrer ved hjelp av 3,0 mm diameter endoskopi slire.
- Bruk mus av samme genetisk bakgrunn, og hvor mulig, fra bur som er lagret på samme stativ for å redusere variasjoner forbundet med tarmens mikroflora. Variasjoner i mikroflora mellom dyre anlegg bør tas i betraktning when bestemme de riktige kontroll mus og genotyper for hvert forsøk 22.
- Mark mus ved øre / tå utklipp, tatoveringer, eller lignende for å gi enkel identifisering.
- Vei mus på dag 0, for å bestemme grunnlinjen eksperimentelle vekter.
- Utføre endoskopi (se avsnitt 5) av mus på dag 0 for å registrere baseline colonic fenotyper.
2. Pre-klinisk studie i en epitelskade og Akutt kolitt Model
- Fremstille en oppløsning av det terapeutiske middel som skal testes. For therapeutics levert av oral sonde (po), utarbeide løsninger til et maksimalt volum på 100 ul. For terapeutiske midler levert av intraperitoneal (ip) injeksjon, fremstille løsninger til et maksimalt volum på 200 ul.
MERK: Gjentatt ip eller po medikament administrering over lengre perioder kan føre til endrede mus atferd. Veksle ip injeksjonsstedet for å unngå langvarig ubehag. For po administrasjon, gi mus med autoclaved solsikkefrø som en "godbit" for å minimere den negative assosiasjon med sonde prosedyren. - På dag 1, administrere den terapeutiske av interesse (utarbeidet i trinn 2.1) og aktuelle kjøretøykontroller. I eksempelet som er vist (figur 6A), 5 ug rekombinant human (rh) iInterleukin (IL) -11-proteinet ble løst opp i 200 ul fosfatbufret saltvann (PBS) og administrert ip
- Bestemme tidspunktet for og hyppigheten av administrasjon, som vil være avhengig av den farmakokinetiske profilen etablert for terapeutisk reagens som blir testet. Figur 1 skisserer profylaktisk behandling ved hjelp av to ganger daglig ip-injeksjoner i løpet av eksperimentet.
- Overvåke, inkludert avføring konsistens og tilstedeværelsen av blod, og veie hver mus daglig. På dagene av behandling, veide bør falle sammen med administrering av et terapeutisk legemiddel minimere slitasje på mus forårsaket av gjentatt håndtering. På dag 3, fremstille 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS løsning i drikkevannet rutinemessig gitt til musene ved dyrefasilitet. Omtrent 5 ml / mus / dag av DSS-løsning er nødvendig for forsøket. Forbruket av DSS vann kan endre seg dersom omgivelsestemperaturen på dyret anlegget svinger.
MERK: DSS er et irritasjonsmoment, og skal håndteres i henhold til HMS-datablad instruksjoner. - Sørg for frisk DSS til musene ad libitum i rene vannflasker for 5 sammenhengende dager. På kvelden Dag 5, gir vanlig drikkevann i tillegg til mashed mat pellets og et protein supplement gitt i små petriskåler (100 g mat pellets / 10 g protein shake / 10 ml vann). Dette forhindrer dehydrering og bistår med å minimere alvorlig vekttap.
- Avlive mus ved CO 2 rus og samle vev for påfølgende histologisk analyse på morgenen Dag 8, eller når musene oppleve ≥15% vekt-tap for mer enn tre consecutive dager, avhengig av hva som inntreffer først.
MERK: Juster DSS dose mellom 1-4% (vekt / volum), avhengig av mikrofloraen i dyrefasilitet og batchen av DSS. Utføre rutine satsvis testing for å fastslå den aktuelle DSS dosering og omgå batch-til-batch-variant. Riktig dosering bør være basert på vekt-tap (ikke større enn 15% av opprinnelig vekt) og bekreftet kolitt histopatologi.
3. Pre-klinisk studie i en kronisk kolitt eller kolitt-assosiert kreft Modell
- For kronisk kolitt modell begynne fra trinn 3.7.
- For kolitt-assosiert kreft (CAC) modell, på dag 1, injisere hver mus med 10 mg / kg (w / w) Azoxymethane (AOM, 250 pl, ip).
MERK: AOM er kreftfremkallende og bør håndteres i henhold til HMS-datablad instruksjoner. - Stamløsninger av AOM fremstilles som 10 mg / ml aliquoter og lagret ved -20 ° C. På dagen for injeksjon, blir AOM stamløsning tint og fortynnet til 1 mg / ml i PBS. Gjentatt frysing og tining av AOM stamløsning bør unngås.
- AOM Dosen kan justeres mellom 8-12 mg / kg. Rutine satsvis testing er nødvendig for å etablere det aktuelle AOM dosering for å omgå giftighet for mus på grunn av batch-til-batch-variant.
- I løpet av 1-7 dager etter AOM administrasjon vekter vil være stabil, og på grunn av dette vekt overvåking kan utelates under 1-7 dager for å unngå håndtering av dyrene som skal skille ut cytotoksiske metabolitter i deres avføring.
- På dag 7 alt sengetøy må endres etter cytotoksiske prosedyrer. Når sengetøy endring er fullført, dyrene ikke lenger kreve cytotoksiske håndteringsprosedyrer, som de ikke lenger vil bli excreting cytotoksiske metabolitter.
- På dag 8, fremstille 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-løsning (som beskrevet i trinn 2.5) og gir til mus ad libitum.
- Veie mus daglig gjennom hele forsøket og overvåke for tegn på sykdom, inkludert ruffled fur, hunching, blodig avføring og redusert bevegelighet.
- På dag 13, fjerne DSS løsning og gi mus med vanlig drikkevann inntil Day 28. Days 8-28 utgjør en "syklus" av kronisk kolitt / CAC-protokollen.
- På Days 13-28, når musene får vanlig drikkevann, gi musene med mashed mat pellets og et protein supplement gitt i små petriskåler (100 g mat pellets / 10 g protein shake / 10 ml vann). Dette forhindrer dehydrering og bistår med å minimere alvorlig vekttap.
MERK: proteintilskudd i mos bør ikke gis når musene får DSS holdig drikkevann for å sikre konsistens i DSS forbruk. - På dag 20 utføre den andre endoskopisk undersøkelse for å overvåke individuelle mus helse (se avsnitt 5).
- På dag 29 gjenta DSS program (program 2: 2,5% (w / v) DSS gitt under Days 29-33 og vanlig drikkevann under Days 34-50).
- På dag 40 utføre third endoskopisk undersøkelse for å overvåke individuelle mus helse og bestemme tumorbelastning (se avsnitt 5).
- Hvis ingen svulster er synlig ved endoskopi på dag 40, begynner en tredje DSS sykle på Days 50-72 (Syklus 3: 2,5% (w / v) DSS gitt under Days 50-55 og vanlig drikkevann under Days 56-72). Vanligvis er synlige tumorer ved dag 40, og derfor den tredje syklus av DSS kan utelates.
- Når svulster blir synlige ved endoskopisk undersøkelse, tilordne hver mus en endoskopisk svulst poengsum (se avsnitt 5) og tildele individuelle mus til kohorter med lignende baseline tumorbelastninger.
- På dag 42 (eller når svulster er synlig), administrere den terapeutiske forbindelse eller relevant kjøretøykontroll (se kapittel 2.2). Timingen av de doser vil være avhengig av den farmakokinetiske profil av det terapeutiske. Et eksempel på en intervensjon behandling injisert ip tre ganger ukentlig i mus med etablerte svulster er gitt (figur 2).
- Utføre endoscopic eksamener en gang per uke i løpet av varigheten av den terapeutiske behandling for å overvåke tumorbyrde. Vanligvis 4 uker med en terapeutisk behandling er tilstrekkelig til å observere en objektiv respons på behandlingen. Etter avsluttet behandling, kan en kohort av mus også overvåkes ved endoskopi for svulst tilbakefall.
- Avlive mus ved CO 2 rus og samle vev til biokjemisk og / eller histologiske analyser på morgenen Dag 72 eller når mus opplever ≥15% vekt-tap for mer enn tre sammenhengende dager, avhengig av hva som inntreffer først.
4. pre-klinisk studie i en Sporadisk Colorectal Cancer Model
- På dag 1, injisere hver mus ip med 10 mg / kg AOM (se trinn 3.2). AOM Dosen kan justeres mellom 8-12 mg / kg. Rutine satsvis testing er nødvendig for å etablere det aktuelle AOM dosering for å omgå giftighet for mus på grunn av batch-til-batch-variant.
- Gjenta injeksjonen på den første dagen i hver ukefor de følgende 5 uker (figur 3). Musene må skje i henhold til cytotoksiske sikkerhetsprosedyrer for hele seks uker.
- Veie hver mus på dag AOM injeksjon for å minimalisere ubehag for mus forårsaket av gjentatt håndtering.
MERK: AOM er kreftfremkallende og bør håndteres i henhold til HMS-datablad instruksjoner. - Alle dyr skal håndteres i henhold til cytotoksiske sikkerhetsprosedyrer for de 6 ukene av AOM ip injeksjoner som kreves for denne protokollen.
- I uke 8 utføre endoskopisk undersøkelse for å overvåke for nye svulster (se avsnitt 5). Endoskopisk undersøkelse bør utføres annenhver uke fram svulster blir synlige. Vanligvis villtype C57Bl / 6 dyr begynner å utvikle tumorer etter omtrent 40 uker etter den første administrering av AOM.
- Når svulster blir synlige ved endoskopisk undersøkelse, tilordne hver mus en endoskopisk svulst poengsum (se avsnitt 5) og tildele individuelle mus til en kohort med lignende tumorbelastninger før oppstart av terapeutisk behandling.
- I løpet av uke 40 (eller når svulster er første synlige), administrere den terapeutiske forbindelse eller den aktuelle kjøretøykontroll.
- Timingen av de doser vil være avhengig av den farmakokinetiske profilen til den terapeutiske (se trinn 2.1). Et eksempel på en intervensjon behandling injisert ip tre ganger ukentlig i mus med etablerte svulster er gitt (figur 3).
- Utføre endoskopisk undersøkelse ukentlig for varigheten av den terapeutiske behandlingsperioder for å overvåke tumorbyrde. Vanligvis 4 uker med en terapeutisk behandling er tilstrekkelig for en objektiv respons på behandlingen. Etter å avslutte behandlingen, kan en kohort av mus også overvåkes ved endoskopi for svulst tilbakefall.
- Avlive mus ved CO 2 rus og samle vev til biokjemisk og / eller histologisk analyse av tykktarmen og svulster i løpet av uke 45, eller etter fire ukers behandling.
- Den endoskopi utstyr skal monteres i henhold til standard prosedyrer 16.
- Sterilisere og rengjøre endoskopet sonde med 70% etanol eller en anti-bakteriell smøremiddel.
- Videoer kan tas opp ved hjelp av en bærbar eller stasjonær datamaskin og standard media programvare, for eksempel iMovie. En vanlig dataskjerm, i stedet for en medisinsk kvalitet skjerm, er tilstrekkelig til å visualisere tykktarmen i løpet av endoskopi måten (figur 4).
- Bedøve grupper av 5-6 mus samtidig i et kammer med 3% isofluran i 100% O 2 med en hastighet på 0,2-0,4 l / min. Når musene bedøvd, noe som bekreftes av toe klemme; de isofluran nivåer bør endres til 0,5-2% for vedlikehold.
- Fjerne en mus fra kammeret, og plasser den ventral side opp med hodet festet i en nese-membran. Full anestesi bør overvåkes og bakbena bør justeres slik at de er stretched ut bak musen.
- Plasser en dyrlege salve på øynene av mus for å forhindre tørrhet.
- Hold halen av musen, hvor den møter den nedre ryggrad og skiller ut anus. Sett stivt endoskop kappe i et begerglass med vann og justere lufttilførselen for å tillate utslipp av en liten boble om gangen.
- Luftstrømmen vil tillate tykktarmen å blåse. Hvis luftstrømmen er for sterk, vil luft pumpes inn i magen på musen. Ingen ekstra smøring er nødvendig.
- Sett forsiktig den stive endoskop skjede inn i endetarmen. Vanligvis kan endoskopet settes opp til 3 cm, noe som medførte at kolon i mus kurver og er ikke tilgjengelig for stive endoskop.
- En vanlig vanskelighet ved endoskopi prosedyrer er blokkering av tilgang til hulrommet i tykktarmen på grunn av fekalt stoff. Unngå dette ved å forsiktig masserer av magen av mus før prosedyren for å oppmuntre avføring, eller forsiktig manøvrering endoskopet rundt fecal løpet under prosedyren. Peristaltikk kan også forekomme, der endoskopet skal holdes i posisjon til tykktarmen muskulaturen slapper av.
- Initiere videoopptak på ethvert stadium av endoskopi prosedyre. Sykdom scoring kan tas opp av en erfaren assistent under inngrepet, eller på et senere tidspunkt fra videofilene.
- Etter endoskopisk undersøkelse, returnere musene til buret sitt og overvåke dem under utvinning fra anestesi. Dyrene er vanligvis våken og mobil innen 2 min etter fjerning fra isofluran administrere nesen membran.
- Sørg for at disse prosedyrene utføres av en erfaren vitenskapsmann. Hver endoskopi prosedyren vil ta ca 2 min per mus.
6. Sykdom Scoring
- Å overvåke kolitt, score videoer for Muse Endoskopisk Index of kolitt Severity (MEICS) 16, som dokumenterer endringer i (i) tykkelsen av kolon veggen indikert av åpenhet, (Ii) avføring konsistens, (iii) blodkar integritet og tilstedeværelse, (iv) magesår og områder av regenerering som presenterer i granulær måte, (v) blødning angitt med fibrin innskudd (figur 5a).
- Å overvåke tumorbyrde, scorer videoer for forekomst av svulster og størrelse. Tumorstørrelse bestemmes av diameteren av colonic lumen okkupert av svulsten 16 (figur 5b). Det er vanlig å bruke både kolitt og tumorscorings parametere for en enkelt mus. Ved hjelp av endoskopi, enkelte svulster og helsen til tykktarmsslimhinnen kan overvåkes over tid, og gir en lese-out for å lykkes med nye behandlingsformer i et enkelt dyr.
- (Valgfritt) stillbilder kan hentes ut fra videoene for generering av representative tall (figur 6).
Representative Results
Vekt-tap blir brukt som en standard parameter som skal overvåkes ved sykdom assosiert med kolitt, som rutinemessig anvendes til å overvåke den totale helsen til mus. Dyrene bryter vanligvis opprettholde sin vekt, mens DSS-inneholdende vann blir administrert, og bare begynne å gå ned i vekt når de returneres til vanlig drikkevann. Akseptable vekttap parametrene bør etableres i samsvar med institusjonens dyreetikk komité. For å hindre dehydrering assosiert med diaré forlenget, bruke rutine bestemmelse av mos (forpelleter most og blandet med drikkevannet) supplert med et protein riste i tillegg til vanlig drikkevann.
Som det kan brukes en alternativ anestesi, ketamin / xylazin eller lignende midler, er hvis isofluran utstyr ikke er tilgjengelig. På grunn av den stive art av endoskopet, bare disse fremgangsmåter muliggjøre visualisering av de mest distale 3 cm av kolon mus. Nyere endoskop med tilleggsfunksjoner (herunder fleksibilitet og fluorescens) er tilgjengelige avhengig av behovene til eksperimentet. Imidlertid, siden de skadelige virkninger av DSS er hovedsakelig begrenset til den distale colon hos mus, med mildere patologi observert i midten colon, den stive endoskopet ikke hindrer overvåking av slimhinne helsen til individuelle mus. Selv om vi beskriver en protokoll for profylaktisk behandling av akutt DSS-indusert kolitt, kan denne protokoll lett modifiseres for å teste intervensjonsbehandlingsstrategier. Effekten av et medikament er utformet for å lindre epitelskade og kolitt kan overvåkes i lengderetningen i enkelte mus og kvantifisert basert på svekningsparametere som er beskrevet (figur 5). Dette er en fordel i forhold til tradisjonelle eksperimentelle design, som krever destruering av mus ved bestemte tidspunkter i løpet av den eksperimentelle protokollen, og ikke tillater karakterisering av sykdommen som reaksjon på en behandling over tid.
t "> Kliniske studier i mennesker har markert betydelig variasjon i hvordan forskjellige tumorer hos en individuell pasient svare på behandlinger. De fremgangsmåtene som er beskrevet her, tilveiebringe et middel for å overvåke totale tumorbyrde, så vel som behandling responsen av individuelle tumorer i løpet av et eksperiment. Det er viktig å tenke på at intervensjons protokoller som er skissert for kreft modellene ikke tar hensyn til effekten av en behandling på startfasen. Forebyggende protokoller, med den behandlingen som gis før når svulster blir synlige med endoskopi, er nødvendig for å oppnå denne informasjonen. De protokoller som er beskrevet her gir informasjon om terapeutiske effekter på på progresjon (målt ved tumorstørrelse) av individuelle tumorer. tumorregresjon kan også være indikert ved en reduksjon i antall synlige svulster.g "/>
Figur 1:. Monitoring effekten av en profylaktisk behandling terapi i en modell av akutt colonic skade Den eksperimentelle protokollen (a) krever 8 dager fra start til ferdigstillelse. Therapeutics administreres (b) fra dag 1 for profylaktiske behandlinger. DSS er anordnet i drikkevann (c) fra dag 3 av forsøksprotokollen. Endos utføres (d) for å overvåke sykdomsprogresjon hos dyrene. Foreslåtte tidspunkter inkluderer dag 0 (ubehandlet) og Dag 2 (helseovervåking), Dag 5 og 8 (for å bestemme sykdomsbyrde). Forsøket avsluttes (e) om morgenen på dag 8. I et villtype-mus (f) progresjon av sykdom øker over tid.
Figur 2: Overvåking effekten av intervensjon terapi i en modell of kolitt-assosiert kreft. Den eksperimentelle protokollen (a) krever 72 dager fra start til fullførelse. Therapeutics (b) administreres til mus med etablerte tumorer fra dag 46 for intervensjons behandlinger. AOM (c) injiseres på dag 1, og DSS er gitt i drikkevann i løpet av tre sykluser av den eksperimentelle protokollen, som begynner på dag 8. Endoskopi (d) er utført for å overvåke sykdomsutvikling hos dyrene. Foreslåtte tidspunkter inkluderer dag 0 (ubehandlet), Dag 20 (helseovervåking), og Dag 40 (til gruppe dyr i henhold til tumorbelastning). Endoskopi er utført ukentlig i løpet av det terapeutiske behandling for å overvåke sykdoms utfall. Eksperimentet (e) er avsluttet morgenen på dag 72. I et villtype-mus (f) tumorbelastning øker fra dag 40 og utover.
Fig. 3: Overvåking av effekten av intervensjonen terapi i en modell av spontan kolorektal kreft Den eksperimentelle protokollen (a) krever> 50 uker fra start til fullførelse. Therapeutics (b) er administrert til mus med etablerte svulster for intervensjons behandlinger. AOM (c) blir injisert på dag 1, og deretter ukentlig i 6 påfølgende injeksjoner i løpet av den eksperimentelle protokollen. Endoskopi (d) utføres for å overvåke sykdomsprogresjon hos dyrene. Foreslåtte tidspunkter inkluderer Dag 0 (ubehandlet) og uke 8 (tumor overvåking) og annenhver uke der etter (for å etablere tumorbelastning). Endoskopi utføres ukentlig i løpet av behandlingen for å overvåke terapeutiske utfall. Eksperimentet (e) avsluttes i uke 50. I en villtype mus (f) tumorbelastning øker fra uke 40 og utover. p>
Fig. 4: Utstyr oppsett Det eksperimentelle oppsettet (a) for endoskopisk enhet, med enkelte deler av utstyret er angitt. Den stive endoskop (b), med enkelte komponenter er angitt. Skala bar = 2,5 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Scoringssykdoms parametere ved endoskopi En disposisjon (a) i muse Endoskopisk Index of kolitt Severity (MEICS). Et omriss (b) av de individuelle tumor treffparametre.es / ftp_upload / 52383 / 52383fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representative terapeutiske behandlinger Representant vekt-tap, endoskopiske bilder og skårer for:. (A) Akutt DSS-indusert slimhinneskader (b) svulster som utvikles etter AOM / DSS-protokollen (c) Svulster som utviklet etter sekvensiell.. AOM protokollen. N = 3 mus pr gruppe. * P <0,05, *** p <0,001 (T-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
De tre protokoller som er beskrevet skissere metoder for pålitelig og reproduserbar induksjon av colonic sykdom patologi hos mus. Når det kombineres med rutine endoskopisk overvåking og intervensjon strategier skissert her, vil disse protokollene gi kraftig pre-klinisk innsikt i effekten av legemiddelselskap. Våre laboratorier rutinemessig bruke alle disse protokollene for å overvåke suksess for romanen therapeutics 10,23,24.
Det finnes en rekke hensyn når du velger en pre-klinisk dyremodell for å teste ut nye behandlingsformer. Disse inkluderer relevansen av modellen til den humane sykdommen, og bidraget av svulsten mikromiljøet til den foreslåtte virkning av det terapeutiske mål. Her gir vi tre protokoller for terapeutisk intervensjon i etablerte tarmsykdomsmodeller. Disse modellene er reproduserbare og levering av reagenser for å indusere sykdom er enkel å administrere. Viktigere er modellene svært relevanttil flere fasetter og stadier av kolitt utbruddet, og av svulst initiering og progresjon. Forskere bør ta hensyn til genetisk bakgrunn av musestammer som brukes ved utforming av eksperimenter, som mottakelighet for sykdom forårsaket av DSS og / eller AOM kan variere betydelig 25. I tillegg kan ulike mikrobielle samfunn har forskjellige metabolske kapasiteter i forbindelse med AOM, som blir metabolisert av bakterier. Vi advarer mot å bruke ulike årskull av mus som ble født inn i forskjellige dyre fasiliteter (inkludert kommersielle leverandører) i et enkelt eksperiment. Tilsvarende kan de forskjellige mikrofloraen hos mus som brukes mellom ulike fasiliteter lokke fram ulike vertsresponser til DSS-indusert epitelial barriere skade 11. Videre bør den aktuelle analyse av vev (for eksempel RNA-rensing) også tas i betraktning, siden evnen til DSS til å inhibere revers transkriptase vil påvirke etterfølgende molekylære analyser 26,27.
Som vår forståelse av inflammatorisk tarmsykdom og kolorektal kreft forhånd, vil nye mål for terapi bli identifisert. Egnede dyremodeller vil være integrert til å sikre at de mest lovende nye behandlingsformer blir flyttet mot kliniske studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla protein shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflurane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fiber optic light cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | Apple | iMovie | |
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
References
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
- Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
- Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
- Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
- Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
- Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
- Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
- Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
- Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
- Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Rose, W. A. 2nd, Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
- Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
- Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
- Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
- Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
- Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
- Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
- Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
