I Utero Intra-hjerte Tomato-lektin injeksjoner på mus embryoer til Gauge Nedsatt Blood Flow

Summary

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Abstract

Dannelse og perfusjon for å utvikle nyre blodkar (bortsett fra glomeruli) er sterkt understudert. Som blodkar utvikler via angiogenese (som er forgrening av av store fartøy) og vaskulogenese (de novo fartøy dannelse), perfusjon kartlegging teknikker som harpiks kaster, in vivo ultralydavbildning, og mikro-disseksjon har vært begrenset i å demonstrere de intime relasjoner mellom Disse to prosesser og utviklingsnyrestrukturer innenfor embryoet. Her beskriver vi prosedyren for i utero intra-kardiale ultralydveiledet FITC-merket tomat lektin microinjections på museembryoer å måle ontogeny av nyreperfusjon. Tomat lektin (TL) ble perfusert i hele embryoet og nyrer høstet. Vev ble co-farget for ulike nyre strukturer, inkludert: nephron stamceller, nephron strukturer, ureter epitel, og blodkar. Starter på E13.5 store kaliber fartøyene ble dynket, men periferfartøy har vært unperfused. Ved E15.5 og E17.5, små perifere kar samt glomeruli begynte å bli dynket. Denne eksperimentelle teknikk er kritisk for å studere rollen til blodkar og blodstrøm under embryonal utvikling.

Introduction

Under embryonal utvikling to adskilte, men samtidig, vaskulære prosesser foregår: angiogenese, prosessen hvor et fartøy vokser fra en større pre-eksisterende fartøy, og vaskulogenese, som er en de novo dannelse av skip fra bolig endoteliale progenitorer ^1,2. Henholdsvis det førstnevnte er synonymt med blodstrømmen, mens det sistnevnte er antatt å hovedsakelig finne sted i fravær av det.

Samtidig med blodkardannelse, begynner en syklisk og dynamisk prosess med nyre stamcelle syntese, spredning og differensiering for å utfolde seg på embryonale dag 9,5 (E9.5). På dette punktet ureteric knoppen (UB) invaderer dorsally inn i omkringliggende metanephric mesenchyme (MM), og fortsetter fram til fødselen ^3. Gjentatte forgrening av UB i hurtig kondense metanephric cap mesenchyme til dannelse av de funksjonelle enheter i nyrene, i nevronet. Med hver ny generasjon av UB og nephron, er eldre generasjoner forskjøvet inn indre kortikale og marg regioner, hvor de deretter gjennomgå ytterligere modning og differensiering innenfor primært vaskulær-tette miljøer. Som vist ved Dressler et al. ^3, er denne embryological prosessen utfelt ved induktiv signalering, så som krysstale mellom UB og MM, og en myriade av ekstracellulære faktorer ^3-6. To nylig undersøkt ekstracellulære faktorer i utviklings bukspyttkjertel og nyrer inkluderer oksygen spenning og blodstrøm ^7,8. Den sistnevnte vil bli omtalt i ytterligere detalj nedenfor med hensyn til nyre- utvikling.

For å avdekke den induktive rolle at blodstrømmen potensielt spiller i nephron stamcelle differensiering, så vel som i andre organogenesis prosesser, presise og nøyaktige metoder for embryonale blodstrøm kartlegging er avgjørende.

Alternative metoder for å måle blodstrøm omfatter forskrivning av ultrasound bildebehandling og harpiks kaster ^9,10. Endelig har disse modi er vist å være iboende mangler i deres evne til å avdekke contemporaneously tidsmessige og romlige sammenstillinger mellom blodstrøm og stamcelledifferensiering. Resin kaster, for eksempel tilveiebringe en gyldig modell av fartøyet mønster innen voksent vev, men i umodne fartøy, for eksempel med embryonale tidspunkter, fartøyer er grovt underutviklet og utett. Derfor kaster harpiks ikke klarer å holde innenfor de små, ofte porøs, fartøyer.

For disse åpenbare hindringer, blant andre, valgte vi å innlemme ultralydveiledet in vivo intra-kardiale embryonale tomat lektin (TL) microinjections inn i våre undersøkelser av nyre utvikling. I denne prosedyren benytter vi en ultralyd probe til synkront lede en montert mikropipette nål fylt med 2,5 mL av TL-løsning inn i venstre hjertekammer museembryoer ved E11.5, E13.5, E15.5 og E17.5 tidspunkter. E170,5 er den nyeste utviklings alder som nålene er ikke sterk nok til å trenge mer utviklet embryo.

Fordelene ved denne metode er mikroinjeksjon rikelig. Ultralydveiledet mikroinjeksjon tillater presis posisjonering av en kanyle i embryonale venstre ventrikkel, passiv og kontrollert utvisning av løsningen i det bankende hjertet på dyret, minimal skade på hjertet og omkringliggende vev, og å unngå plutselig hjertesvikt og død embryo før full-body perfusjon. Med bruk av et FITC-merket TL, vil en hvilken som helst perfusert vaskulatur opprett markøren langs sin endotelial apikale membran. I kombinasjon med immunhistokjemi, utnytte PECAM (CD31, blodplater endothelial celleadhesjonsmolekyl) og diverse andre vaskulære markører, er vi i stand til å skille klart mellom perfundert og un-perfusert fartøy, samt karakterisere noen avvikende farging av omkringliggende vev.

Protocol

MERK: The University of Pittsburgh Institutional Animal Care og bruk komité godkjente alle forsøk. 1. Utarbeidelse av Ultralyd-mikroinjeksjon Instrumenter og embryoer Sette opp scenen, mount, og probe (figur 1), samt kirurgiske instrumenter (figur 2). Sted fosfatbufret saltvann (PBS) løsning (pH 7,4) i en 37 ° C varmebadet. Fyll mikroinjeksjon nålen helt med mineralolje, ved anvendelse av 1 ml sprøyte festet til et andre fleksibelt 25 G nål, gjennom sin base. <…

Representative Results

Vaskulær formasjon foran flyt i å utvikle nyre Et flertall av embryonale vev (inkludert nyre) inneholder en tett vaskulaturen (både unperfused og perfusert), selv ved tidlig fosterdød tidspunkter. For bedre å måle og analysere blodgjennomstrømningen i å utvikle nyre benyttet vi en metode for i utero embryonale intrakardielle microinjections. Med bruk av en høy oppløsning ultralyd for å identifisere den embryonale hjertet ved E11.5 gjennom E17.5, og etter utvinning og eksponering a…

Discussion

Mikroinjeksjon anestesi og tidsramme

Med hensyn til bedøvelsen av moren, er det viktig å holde luftmengden konstant (2-3 l / min) og ved lav PSI. Flyten av beroligende må holdes på ca 1,75 til 2 l / min. Samtidig må tidsrammer der injeksjoner foregår overvåkes nøye og kontrolleres for med hvert kull. For hvert kull injeksjonsprosedyren bør holdes under 45 min. Betydningen av denne tidsgrense er av vesentlig betydning for eksperimentet, som hvert embryo må opprettholdes innenfor en …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5µL / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
mL syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10