В Utero Intra-сердечная томатно-лектин инъекций по эмбрионов мыши, чтобы измерить почек кровотока
Summary
This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.
Abstract
Формирование и перфузии развития почечной кровеносные сосуды (кроме клубочков) значительно изучено недостаточно. Как сосудистой развивается с помощью ангиогенеза (который ответвляется крупных сосудов) и васкулогенез (De Novo образования сосудов), методы картирования перфузии, такие как смолы слепков, в естественных условиях ультразвуковой визуализации и микро-рассечение были ограничены в демонстрации интимных отношений между эти два процесса и развития почечной структуры в зародыше. Здесь мы опишем процедуру внутриутробному внутри сердца под ультразвуковым контролем FITC-меченных томатов лектин микроинъекций на эмбрионах мыши, чтобы измерить онтогенез почечной перфузии. Томатный лектин (TL) заливают по всему эмбриону и почек урожая. Ткани совместно окрашивали для различных структур почек, включая: нефрона предшественников, нефрона структур, мочеточника эпителия и сосудов. Начиная с E13.5 крупных сосудов калибра перфузировали, однако периферическойсосуды оставались unperfused. По E15.5 и E17.5, небольшие периферические сосуды, а также клубочки начал становиться перфузии. Это экспериментальная методика имеет решающее значение для изучения роли сосудистой и кровотока во время эмбрионального развития.
Introduction
Во время эмбрионального развития два дискретные, но одновременно, сосудистые процессы происходят: ангиогенез, процесс, при котором сосуд растет от основной предварительно существующего судна, и васкулогенезе, который заново образование сосудов из жилых эндотелиальных клеток-предшественников 1,2. Соответственно, первое является синонимом кровотока, а второй, как полагают, в значительной степени имеют место в отсутствие него.
Одновременно с образованием кровеносных сосудов, циклический и динамичный процесс синтеза почек клеток-предшественников, пролиферации и дифференцировки начинает разворачиваться на день эмбрионального 9,5 (E9.5). На данный момент мочеточника бутон (UB) вторгается дорсально в окружающую метанефрической мезенхиму (мм), и продолжается до рождения 3. Повторное разветвление UB в быстро конденсации метанефрической крышки мезенхимы начинается формирование функциональных подразделений почек, нефрона. С каждым новым поколением УБ и НефРон, старшие поколения смещаются во внутренние коркового и мозгового регионах, где они затем подвергаются дальнейшему созреванию и дифференциации в первую очередь сосудисто-плотных средах. Как видно из Дресслера и др., 3, этот процесс эмбрионального осаждают индуктивной передачи сигналов, таких как перекрестные помехи между UB и ММ, и множество внеклеточных факторов 3-6. Два недавно исследовали внеклеточные факторы в рамках развивающегося поджелудочной железы и почки включают напряжение кислорода и кровоснабжение 7,8. Последнее будет обсуждаться более подробно ниже со отношению к развитию почек.
Для того, чтобы подвергать индуктивный роль, что поток крови потенциально играют в дифференциации клеток-предшественников нефрона, а также в других процессах органогенеза, точных и точных методов эмбрионального отображения кровотока является обязательным условием.
Альтернативные методы замера кровоток включают рецепт улtrasound изображений и смолы бросает 9,10. Окончательно, эти режимы, как было показано, чтобы быть по своей природе не хватает в их способности одновременно обнародует временные и пространственные сопоставления между кровотоком и дифференцировку стволовых клеток. Смола отливок, например, обеспечить действительное модель сосуда рисунка в тканях взрослого организма, однако в незрелых сосудов, таких как эмбриональные с моментами времени, сосуды сильно развиты и вытекающей. Таким образом, смола бросает не проведет в крошечных, часто пористый, сосудов.
Для этих очевидных препятствий, в частности, мы решили включить УЗИ наведением в естественных условиях внутри сердца эмбриональных помидор лектина (TL) микроинъекций в наших исследованиях развития почек. В этой процедуре мы используем ультразвуковой зонд синхронно направлять установленный микропипетки иглы, наполненный 2,5 мкл TL раствора в левый желудочек из мышиных эмбрионов в точках E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 и время. E170,5 является последняя возраст развитием, иглы не достаточно сильны, чтобы проникнуть в более развитый эмбрион.
Преимущества этого метода микроинъекции в изобилии. Ультразвуковая руководствуясь микроинъекции позволяет точно позиционировать иглу для инъекций в течение эмбрионального левого желудочка, пассивный и контролируемое изгнание раствора в бьющееся сердце животного, минимальным ущербом для сердца и окружающих тканей, и во избежание внезапной сердечной недостаточности и смерти эмбрион до полного тела перфузии. С использованием FITC-меченого TL, любой перфузии сосудистой будет поддерживать маркер вдоль ее эндотелиальной апикальной мембране. В сочетании с иммуногистохимии, используя PECAM (CD31, тромбоцитов эндотелия молекулы клеточной адгезии) и различные другие сосудистые маркеры, мы можем четко различать перфузируемые и ООН-перфузии сосудов, а также охарактеризовать любые аберрантные окрашивание окружающих тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроинъекция анестезия и временные рамки
Что касается анестезии матери, важно, чтобы поток воздуха константу (2-3 л / мин) и при низкой PSI. Поток успокоительное должно быть проведено примерно в 1.75-2 л / мин. Одновременно, сроки, в которых инъекции происходят должны быть тесн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5µL / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
- Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
- Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
- Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
- Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
- Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
- Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
- Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
- Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).
