I Utero intrakardielle Tomat-lectin injektioner på museembryoer at måle den renale blodgennemstrømning

Summary

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Abstract

Dannelsen og perfusion for at udvikle nyre blodkar (bortset fra glomeruli) er stærkt dublerede. Som vaskulatur udvikler via angiogenese (som er den forgrening af større skibe) og vaskulogenese (de novo fartøj dannelse), teknikker perfusion kortlægning såsom harpiks afstøbninger, in vivo ultralydsscanning og mikro-dissektion er begrænset i at demonstrere de intime relationer mellem disse to processer og udvikle nyre strukturer i embryoet. Her beskriver vi proceduren for in utero intrakardielle ultralyd-styrede FITC-mærkede tomat lectin mikroinjektioner på museembryoer at måle ontogenese af renal perfusion. Tomat lektin (TL) blev perfunderet hele embryo og nyrer høstet. Væv blev co-farvet for forskellige nyre strukturer, herunder: nephron stamceller, nephron strukturer, ureteric epitel og kar. Starter ved E13,5 store kaliber fartøjer blev perfunderet dog perifertskibe forblev unperfused. Ved E15.5 og E17.5, små perifere kar samt glomeruli begyndt at blive perfunderet. Denne eksperimentelle teknik er kritisk for at studere rollen af ​​vaskulatur og blodgennemstrømningen under fosterudviklingen.

Introduction

Under fosterudviklingen to adskilte, men samtidige, vaskulære processer foregår: angiogenese, en proces, hvorved et fartøj vokser fra en større præ-eksisterende fartøj, og vaskulogenese, som er en de novo dannelsen af fartøjer fra hjemmet endotheliale progenitorer ^1,2. Henholdsvis førstnævnte er synonymt med blodgennemstrømning, mens sidstnævnte menes at stort set finder sted i fravær af det.

Samtidig med dannelsen af ​​blodkar, en cyklisk og dynamisk nyre progenitorcelle syntese, proliferation og differentiering begynder at udfolde sig på embryonisk dag 9,5 (E9.5). På dette tidspunkt den ureteric opløbet (UB) invaderer dorsalt i omgivende metanephric mesenchyme (MM), og fortsætter indtil fødslen ^3. Gentagne forgrening af UB ind hurtigt kondenserende metanephric kasket mesenchym begynder dannelsen af ​​de funktionelle enheder i nyren, nephron. Med hver ny generation af UB og Nephron, er ældre generationer forskydes ind indvendige kortikale og medullære regioner, hvor de derefter undergår yderligere modning og differentiering inden primært vaskulær-tætte miljøer. Som det fremgår af Dressler et al. ³ er denne embryologisk proces udfældes ved induktiv signalering, såsom krydstale mellem UB og MM, og et utal af ekstracellulære faktorer ^3-6. To nyligt undersøgte ekstracellulære faktorer inden for udvikling af bugspytkirtel og nyrer omfatter oxygenspænding og blodgennemstrømningen ^7,8. Sidstnævnte vil blive diskuteret mere detaljeret nedenfor med hensyn til nyre udvikling.

For at blotlægge den induktive rolle, blodgennemstrømning potentielt spiller i nephron progenitorcelle differentiering, såvel som i andre organogenese processer, præcise og nøjagtige metoder til embryonale blodgennemstrømning mapping er nødvendigt.

Alternative metoder til at måle blodgennemstrømning omfatter ordinering af ultrasound billedbehandling og harpiks kaster ^9,10. Sammenfattende har disse tilstande vist sig at ligge i sagens natur mangler i deres evne til samtidigt afsløre tidsmæssige og rumlige sammenstillinger mellem blodgennemstrømning og stamcelle differentiering. Resin afstøbninger, for eksempel, en gyldig model for fartøj mønster i voksent væv, men i umodne skibe, såsom med embryonale tidspunkter, fartøjerne er groft underudviklet og utætte. Derfor harpiks kaster undlader at holde inden for de små, ofte porøs, fartøjer.

For disse åbenbare forhindringer, blandt andre, valgte vi at indarbejde ultralyd-vejledt in vivo intrakardielle embryonale tomat lectin (TL) mikroinjektioner i vores undersøgelser af nyre udvikling. I denne procedure udnytter vi en ultralydsonde til synkront lede en monteret mikropipette nål fyldt med 2,5 pi TL opløsning ind i den venstre ventrikel af musefostre ved E11.5, E13,5, E15.5 og E17.5 tidspunkter. E17.5 Er den seneste udviklingsmæssige alder som nåle ikke er stærke nok til at trænge ind i mere udviklede foster.

Fordelene ved denne mikroinjektion metode er rigelige. Ultralyd-vejledt mikroinjektion tillader præcis positionering af en kanyle i den embryonale venstre ventrikel, passiv og kontrolleret udvisning af opløsningen i det bankende hjerte af dyret, minimal skade på hjerte og omgivende væv, og undgåelse af pludseligt hjertesvigt og død embryo inden hele kroppen perfusion. Med anvendelse af en FITC-mærket TL, vil enhver perfunderet vaskulatur opretholde markør langs dens endotel apikale membran. I kombination med immunhistokemi, udnytte PECAM (CD31, Platelet endotel celleadhæsionsmolekyle) og forskellige andre vaskulære markører, er vi i stand til klart at skelne mellem perfusioneret og un-perfunderet skibe, samt karakterisere enhver afvigende farvning af omgivende væv.

Protocol

BEMÆRK: University of Pittsburgh Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendte alle forsøg. 1. Fremstilling af ultralyd-mikroinjektion Instrumenter og embryoner Opsætning scenen, mount, og sonde (figur 1) samt kirurgiske instrumenter (Figur 2). Place phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning (pH 7,4) i en 37 ° C opvarmning bad. Fyld mikroinjektion nålen helt med mineralsk olie under anvendelse af 1 ml sprøjte fastgjort til en anden fleksibel 25 G nål, genne…

Representative Results

Vaskulær formation forud flow udvikle nyre Et flertal af embryonisk væv (herunder nyre) indeholder et tæt vaskulatur (både unperfused og perfunderet), selv på tidlige embryoniske tidspunkter. For bedre gauge og analysere blodgennemstrømningen i udviklingslandene nyre vi udnyttet en fremgangsmåde in utero embryonale intrakardiale mikroinjektioner. Med brug af en høj opløsning ultralyd til at identificere den embryonale hjerte ved E11.5 gennem E17.5, og efter ekstraktion og eksponerin…

Discussion

Mikroinjektion anæstesi og tidsramme

Med hensyn til bedøvelse af moderen, er det vigtigt at holde luftstrømmen konstant (2-3 l / min) og ved lav PSI. Strømmen af ​​beroligende skal holdes på ca. 1,75-2 l / min. Samtidig skal tidsrammer, hvor injektionerne foregår nøje overvåges og kontrolleres for hver kuld. For hvert kuld injektionsproceduren bør holdes under 45 min. Betydningen af ​​denne frist er altafgørende for eksperimentet, som hver embryo skal holdes inden for en ko…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5µL / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
mL syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10