माउस भ्रूण पर Utero इंट्रा-हृदय टमाटर लेक्टिन इंजेक्शन में गुर्दे रक्त प्रवाह गेज करने के लिए
Summary
This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.
Abstract
गठन और (अलावा ग्लोमेरुली से) गुर्दे की रक्त वाहिकाओं के विकास का छिड़काव बहुत understudied कर रहे हैं। वाहिका संरचना ऐसी राल डाले, vivo में अल्ट्रासाउंड इमेजिंग, और माइक्रो विच्छेदन के रूप में छिड़काव मानचित्रण तकनीक के बीच अंतरंग संबंधों का प्रदर्शन में सीमित कर दिया गया है, (डी नोवो पोत गठन) और vasculogenesis (प्रमुख वाहिकाओं के बंद शाखाओं में बंटी है) angiogenesis के माध्यम के रूप में विकसित भ्रूण के भीतर इन दोनों प्रक्रियाओं और विकासशील गुर्दे संरचनाओं। यहाँ, हम गुर्दे छिड़काव की व्यक्तिवृत्त गेज करने के लिए माउस भ्रूण पर गर्भाशय इंट्रा-कार्डियक अल्ट्रासाउंड निर्देशित FITC लेबल टमाटर लेक्टिन microinjections में की प्रक्रिया का वर्णन। टमाटर लेक्टिन (टीएल) काटा भ्रूण और गुर्दे भर perfused किया गया था। नेफ्रॉन पूर्वज, नेफ्रॉन संरचनाओं, ureteric उपकला, और vasculature: ऊतकों सहित विभिन्न गुर्दे की संरचनाओं के लिए सह दाग रहे थे। E13.5 बड़े कैलिबर जहाजों पर प्रारंभ हो, हालांकि परिधीय perfused थेजहाजों unperfused बने रहे। E15.5 और E17.5 करके, छोटे परिधीय जहाजों के साथ ही ग्लोमेरुली perfused हो शुरू कर दिया। इस प्रयोगात्मक तकनीक भ्रूण के विकास के दौरान vasculature और रक्त के प्रवाह की भूमिका का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
Introduction
भ्रूण के विकास के दौरान दो असतत, अभी तक एक साथ, संवहनी प्रक्रियाओं जगह ले: एंजियोजिनेसिस, प्रक्रिया एक पोत आवासीय endothelial पूर्वज 1,2 से जहाजों के एक नए सिरे से गठन है, जो एक प्रमुख पूर्व मौजूदा पोत, और vasculogenesis से बढ़ता है जिससे। उत्तरार्द्ध में काफी हद तक यह के अभाव में जगह लेने के लिए सोचा है, जबकि क्रमश: पूर्व, रक्त प्रवाह के साथ पर्याय बन गया है।
रक्त वाहिनियों के गठन के लिए एक साथ, गुर्दे पूर्वज सेल संश्लेषण, प्रसार, और भेदभाव के एक चक्रीय और गतिशील प्रक्रिया भ्रूण दिन 9.5 (E9.5) पर प्रकट करने के लिए शुरू होता है। इस बिंदु पर ureteric कली (यूबी) metanephric mesenchyme (एम एम) के आस-पास में पीछे की ओर आक्रमण, और जन्म के 3 जब तक जारी है। तेजी से metanephric टोपी mesenchyme संघनक में यूबी की शाखाओं में बंटी दोहराया गुर्दे के कार्यात्मक इकाइयों, नेफ्रॉन के गठन शुरू होता है। यूबी और neph की हर नई पीढ़ी के साथरॉन, पुरानी पीढ़ी के वे तो मुख्य रूप से संवहनी घने वातावरण के भीतर आगे परिपक्वता और भेदभाव से गुजरना जहां भीतरी cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों में विस्थापित कर रहे हैं। Dressler एट अल। 3 से सबूत के रूप में, इस embryological प्रक्रिया ऐसी यूबी और मिमी, और बाह्य कारकों 3-6 के असंख्य बीच crosstalk के रूप में, प्रेरक संकेतन से उपजी है। दो हाल ही में जांच की कोशिकी विकासशील अग्न्याशय के भीतर कारकों और गुर्दे ऑक्सीजन तनाव और रक्त प्रवाह 7,8 शामिल हैं। उत्तरार्द्ध गुर्दे विकास के संबंध के साथ नीचे आगे विस्तार से चर्चा की जाएगी।
रक्त का प्रवाह संभावित नेफ्रॉन पूर्वज सेल भेदभाव, साथ ही साथ में अन्य जीवोत्पत्ति प्रक्रियाओं, भ्रूण रक्त प्रवाह मानचित्रण की सटीक और सही तरीकों में खेलता है कि प्रेरक भूमिका को बेनकाब करने के क्रम में आवश्यक है।
रक्त के प्रवाह को नापने के वैकल्पिक तरीकों उल के पर्चे में शामिलtrasound इमेजिंग और राल 9,10 डाले। अंतिम तौर से, इन मोड स्वाभाविक समकालीन रक्त के प्रवाह के बीच अस्थायी और स्थानिक juxtapositions अनावरण और सेल भेदभाव स्टेम करने के लिए अपनी क्षमता में कमी होने के लिए दिखाया गया है। राल डाले, उदाहरण के लिए, हालांकि इस तरह के भ्रूण समय बिंदुओं के रूप में साथ अपरिपक्व वाहिकाओं में, वयस्क ऊतकों के भीतर पोत patterning के एक वैध मॉडल उपलब्ध कराने, बर्तन निहायत अविकसित और टपकाया हैं। इसलिए, राल, बार बार झरझरा, छोटे जहाजों के भीतर पकड़ के लिए असफल डाले।
इन स्पष्ट बाधाओं के लिए, दूसरों के बीच में, हम अल्ट्रासाउंड निर्देशित गुर्दे विकास की हमारी जांच में इन विवो इंट्रा-हृदय भ्रूण टमाटर लेक्टिन (टीएल) microinjections में शामिल करने के लिए चुना है। इस प्रक्रिया में हम तुल्यकालिक E11.5, E13.5, E15.5, और E17.5 समय बिंदुओं पर माउस भ्रूण के बाएं वेंट्रिकल में टीएल समाधान के 2.5 μl से भरा एक घुड़सवार micropipette सुई मार्गदर्शन करने के लिए एक अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग। E17सुइयों और अधिक विकसित भ्रूण घुसना करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं कर रहे हैं के रूप में 0.5 नवीनतम विकास युग है।
इस microinjection के विधि के फायदे प्रचुर मात्रा में हैं। अल्ट्रासाउंड निर्देशित microinjection की सटीक भ्रूण बाएं वेंट्रिकल के भीतर एक इंजेक्शन की सुई की स्थिति, पशु, दिल को न्यूनतम क्षति और आसपास के ऊतकों के दिल की धड़कन में समाधान के निष्क्रिय और नियंत्रित निष्कासन, और अचानक हृदय की विफलता के परिहार और मृत्यु की अनुमति देता है भ्रूण पूरे शरीर छिड़काव करने से पहले। एक FITC लेबल टीएल के उपयोग के साथ, किसी भी perfused वाहिका अपने एन्दोथेलिअल शिखर झिल्ली के साथ मार्कर को बनाए रखना होगा। Immunohistochemistry के साथ संयोजन में, PECAM (CD31, प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु) और विभिन्न अन्य संवहनी मार्कर का उपयोग, हम स्पष्ट रूप से करने में सक्षम हैं perfused और संयुक्त राष्ट्र के perfused जहाजों के बीच अंतर है, साथ ही आसपास के ऊतकों के किसी भी न्यायपालिका धुंधला विशेषताएँ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjection संज्ञाहरण और समय सीमा
मां की anesthetization का संबंध है, यह airflow के निरंतर (2-3 एल / मिनट) और कम साई में रखने के लिए आवश्यक है। शामक के प्रवाह / मिनट लगभग 1.75-2 एल में आयोजित किया जाना चाहिए। इसके साथ ही, इंज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5µL / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
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