Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Summary

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Abstract

Hücre-matris yapışma hücre morfolojisini kontrol ve sinyalizasyon önemli bir rol oynar. Hücre-matris yapışma (örneğin, miyeloperoksidaz ve diğer matris düzenleyici oksidanlar / iltihap sırasında ortaya çıkan enzimler) bozan etmenler de hastalıkların bir dizi hücresel fonksiyonu, fenotip ve canlılığı patolojik değişiklikleri tetikleyerek söz konusu olmaktadır. Burada, (a patofizyolojik matris düzenleyici uyarıcı olarak endotel hücreleri ve myeloperoksidaz ile), hücre-alt-tabaka empedans ve canlı hücre görüntüleme teknikleri kolayca doğru hücre yapışmasının ve matris modifikasyonu ile indüklenen de yapışma gerçek zamanlı değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir açıklanmıştır Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip ve non-invaziv bir şekilde. XCELLigence hücre alt-tabaka empedans sistemi sürekli altın mikroelektrot diziler üzerinde yetiştirilen hücreler, hücre-alt-tabaka ara yüzeyinde elektrik empedansı ölçmek suretiyle hücre-matris yapışma alanını ifade etmektedir. Resim analizi zaman atlamalı ayırıcısıcaklık üzerindeki girişim zıtlık filmler hücre-matris temas alanında değişiklikleri temsil eden zaman içinde, tek tek hücrelerin öngörülen alan değişiklikleri ifade etmektedir. Her iki teknik doğru hücresel yapışma ve de-yapışma süreçlerine hızlı değişiklikler ölçmek. Mikroelektrot biyosensör dizileri Hücre-substrat empedans sağlam, yüksek hacimli ölçümler için bir platform sağlar. Canlı hücre görüntüleme hücre-substrat empedans ölçümleri ile sayısal morfolojik değişikliklerin doğası ve dinamikleri ile ilgili ek detay sağlamak analizleri. Bu tamamlayıcı yaklaşımlar hücre içi hücre dışı matris bileşenleri miyeloperoksidaz-katalize oksidatif modifikasyonu hızlı hücre yapışması, morfolojisi değişiklikler ve endotel hücreleri sinyal tetikler nasıl değerli yeni anlayışlar sağlar. Bu yaklaşımlar, diğer matris-modifiye uyarılara ve ilgili diğer yapışıcı hücreler (örneğin, epitelyal hücreleri) yanıt olarak hücre yapışma dinamiğini çalışmak için de geçerlidir.

Introduction

Hücreler ve kendi çevre hücre dışı matris arasındaki kararlı yapışkan temas doku homeostazının muhafaza için gereklidir. Örneğin, kan damarlarında endotel altı matris endotelyal hücre yapışma endotelyal tabakanın bütünlüğünü ve düzenleme, yarı geçirgen bir bariyer vasküler ¹ olarak homeostatik fonksiyonunu korumada bir rol oynar. aktin hücre iskeleti mekanik merkezi yönlendirilmiş aktomizin çekme güçlerine karşı hücre zarı konumunu belirlemede önemli bir rol oynadığı hücre-matris arayüz de hücre-matris yapışma ve yapışkan temas bölgelerinde matris moleküllerini yapışkan ile birleştirilir. Mutlaka hücre-matriks arayüzünde güçler dengesini, hızla bir olay alter hücre-matriks yapışmasını değiştiren Ekstrasellüler uyaranlara "dış-iç sinyal" transdüksiyonunda sonuçlanan, mekano duyarlı sinyal proteinleri tarafından 'algılanan'. Bu çapraz-konuşma bahisrinde hücreleri ve kendi çevre hücre dışı matris hücre şekli, motilite, işlev proliferasyonu ve hayatta kalma ² kontrol edilmesinde anahtar bir rol oynar.

Çeşitli pato-fizyolojik süreçler (embriyonik gelişme, iltihaplanma, yara iyileşmesi, kanser metastazı) matris derecelendirme oksidanlar ve / veya enzimler ^3,4 yapışkan matris maddeleri dinamik yeniden ile karakterize edilir. Örneğin, kan damarlarında endotel altı matris proteinleri yapışkan (örneğin, fibronektin) bağlı reaktif oksidanlar lokal üretimi için insan iltihaplı hastalıklarda değiştirilmesi veya bozulması için önemli bir hedef olarak implike edilmiştir (örneğin, hipokloröz asit, HOCl) lökositten türetilmiş bir enzimle inflamatuar damar hastalığı (Şekil 1) ^5-9 esnasında subendotelyuma içinde birikir miyeloperoksidaz (MPO),. MPO türetilmiş oksidanlar ve diğer matris-modifiye, uyarıcıya tepki olarak hücre-matris yapışma değişiklikler lik olanda endotel fonksiyonu ve bariyer bütünlüğünü bozarak endotel hücre sinyal, morfolojisi ve canlılığı, değiştirerek, örneğin; ely patolojik süreçlerin çeşitli sırasında vasküler homeostazı değiştirerek önemli roller oynamaya. Ancak, hücre dışı matriks değişiklikler yapışık hücrelerin morfolojik ve hücre sinyal tepkiler sadece anlaşılmaya başlıyor.

Matris değişiklikler hücre yapışması dinamikleri ve yapışma-bağımlı hücre sinyal yolları değişiklikleri sürücü anlamak için, teknikler doğru yüksek zamansal çözünürlüğe sahip, gerçek zamanlı hücre-matriks yapışma değişiklikleri ölçmek olduğunu gereklidir. Burada, biz tamamlayıcı hücre-substrat empedansını ve bu kriterleri yerine getirmek ve non-invaziv bir şekilde hücre yapışmasını ve de-yapışma süreçleri ölçmek için bir platform sağlamak canlı hücre görüntüleme teknikleri tarif.

Biz göstermek nasıl bu hücre-substrat empedans ve canlı hücre görüntüleme beğenmeağrıları hali hazırda hücre eki dinamiklerini izlemek ve doğal ve modifiye matris substratlar üzerine (örneğin, de novo hücre yapışması) yayılma ve (ii) (örneğin, de-yapışma hücre-matris ayrılma dinamiklerini ölçmek için (i) için kullanılabilir ) matris-modifiye uyaranlara maruz yapışık hücreler tarafından. XCELLigence hücre alt-tabaka empedans biyosensör sistemi 96 oyuklu altın mikroelektrot dizileri yüzeyinde elektrik empedansı ölçmek suretiyle hücre-matris temas alanının bir sürekli ölçme, "hücre dizini ', boyutsuz bir değerdir ve bu elektrik empedans ölçümleri ifade eden Ayrıca (yalıtım) hücre zarı ve elektrot yüzeyi ¹¹ arasındaki ortalama mesafe değişikliklere duyarlı varlık iken, hücre-substrat teması ¹⁰ (Şekil 2) alanına büyük ölçüde orantılıdır. Hücre indeksi değerleri bakımından bir başka artış da sıkı hücre-hücre temas tha oluşması ile elde edilirt, bu çalışmada açıklanan deneyler içinde geçerli değil ¹¹ koşullarını paraselüler akım akar kısıtlamak. Hızlandırılmış diferansiyel girişim kontrast resim analizi ile, zaman içinde hücre çıkıntı yapan alanının ölçümü (DIC), filmler hücre alt-tabaka temas alanında değişiklik tamamlayıcı ölçümünü sağlar ve kesin yapısı ve dinamikleri ile ilgili ek bilgiler sağlar Hücre-substrat empedans yaklaşımı ile ölçülebilir morfolojik değişimler.

Özellikle, (örneğin, fibronektin): (i) yapıştırıcı, alt endotelial matris proteinlerinin oksidasyon MPO aracılı nasıl kullanıldığını izlemek arıtıldı fibronektin ve (ii) tetikler hücre-matris de üzerine süspansiyon endotel hücreleri de novo yapışmasını azaltır, bu yaklaşımların bir uygulama tarif fibronektin kurulan yapışması ile endotel hücreleri -yapışma. Paralel hücre sinyal gerçekleştiren ilgili Biochem kullanarak zamanla analizleri ilenik deneyler (örneğin, Western blot), yapışma bağımlı hücre sinyal olayları adezyon / de-yapışma süreçleri ve ilgili değişiklikleri arasındaki zamansal ve nedensel ilişki belirlenebilir.

Bu yaklaşımlar en son MPO subendotelyal yatakları ile katalize hücre dışı matris oksidasyon önceden var olan aktomizin kasılma güçleri ⁹ tarafından tahrik edilen endotel hücrelerinin hücre-matris yapışma hızlı kayıp tetikler olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Önemlisi, hem hücre yapışması değişiklikler ve tespit edilecek sinyal yapışma bağımlı hücre arasındaki zamansal ilişki sağlayarak, bu yaklaşımlar MPO kaynaklı matris modifikasyonu ve hücresel de-yapışma Src kinaz gibi önemli yapışma-bağımlı hücre sinyal yolları değişiklikleri tetikler olduğu tespit bağımlı paxillin fosforilasyon ve miyosin hafif zincir II fosforilleme (Şekil 1) ^9. Redoks-bağımlı sinyal, inv Bu modhücre-matris yapışmasını bozan hücre dışı oksidatif reaksiyonları ile hücre içi sinyal olaylarının aktivasyonu SORUN hücrenin yeni bir şekli "dışarıdan içeriye redoks sinyal" (Şekil 1) olarak adlandırılan sinyalizasyon temsil ^9.

Genel olarak, bu tamamlayıcı hücre alt-tabaka empedans biyosensör ve canlı hücre görüntüleme teknikleri matris düzenleyici uyarı ya da maddeler, hücre yapışması dinamiği, morfoloji değişiklikleri sürücü kadar farklı ifşa ve çeşitli tabi olan farklı yapışık hücre türleri içinde sinyalizasyon değerli olmalıdır Deneysel ayarları.

Aşağıdaki protokol de novo endotel hücre yapışması (Deney 1) ve endotel hücre de-yapışma (Deney 2) süreçleri üzerinde MPO-aracılı matris oksidasyon etkisini ölçmek açıklamaktadır. MPO fibronektin ve diğer yapıştırıcı subendotelyal hücre dışı matriks proteinleri ve bize heyecanla bağlanıres _{(H2O 2)} klorid iyonu (Cı ^-) dönüştürmek için hidrojen peroksit, bu matris proteinleri ile lokal olarak reaksiyona girer ve hücre yapışma özelliklerini (Şekil 1) ^8,9 bozan yüksek reaktif bir klorlama oksitleyici hipokloröz asit (HOCI) ^{'e, 12.}

Protocol

1. General Endothelial Cell Culture Culture bovine aortic endothelial cells (passages 4–9) on gelatin-coated tissue culture flasks (coat tissue culture surface with 0.1% w/v gelatin in PBS at RT for 15 min) in EGM-2 media (with the EGM-2 bullet kit containing 5% fetal bovine serum, growth factors and all supplements provided by the manufacturer, except for hydrocortisone). When cells are near-confluent (ca. 3 days post seeding after a 1:4 split), harvest cells by treatment with 0.05% w/v tryps…

Representative Results

Real-time quantification of endothelial cell de-adhesion from fibronectin in response to MPO-mediated fibronectin oxidation (Experiment 2). The seeding of endothelial cell suspensions onto native (MPO free) fibronectin or MPO-bearing fibronectin results in maximal cell attachment and spreading within 2 hr, as judged by a plateauing of cell index values in the cell substrate impedance measurements (Figure 3A). This initial phase of cell attachment and spreading is markedly reduced when MP…

Discussion

Cell-matrix adhesion and de-adhesion processes can be quantified accurately in real time with high temporal resolution using cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These real-time approaches provide a major advantage over end-point analyses of cell adhesion, which provide poor temporal resolution. By accurately quantifying rapid de-adhesion responses with high temporal resolution, these analyses can provide critical insights into how morphological responses to matrix modifications are regulated and how …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array	ACEA Biosciences / Roche	E-Plate 96	single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system
blebbistatin	Sigma	B0560	selective inhibitor of non-muscle myosin-II
Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved	Lonza	BW-6001
Bovine serum albumin	Sigma	05470
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	endothelial cell growth media kit
Fibronectin, lyophilized powder	Sigma	F-4759	from bovine plasma
Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish	World Precision Instruments	FD35-100	Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging
Gelatin from bovine skin	Sigma	G9391	cell culture substratum
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025076
Hydrogen peroxide	Merck	107298
Medium-199	Life Technologies	11150-059	serum-free cell media
Methionine	Sigma	M9500	quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase
Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes	Millipore	475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system	ACEA Biosciences / Roche	–	Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit
Trypsin-EDTA (0.5%)	Gibco	15400-054