Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare continuamente i processi di adesione cellulare e de-adesione con alta risoluzione temporale in modo non invasivo per impedenza cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci rivelano le dinamiche dei processi di adesione cellulare / de-adesione innescato da modifica della matrice e la loro relazione temporale con gli eventi di segnalazione adesione-dipendente.
Abstract
Adesione cellulare matrice gioca un ruolo chiave nel controllo della morfologia cellulare e di segnalazione. Stimoli che sconvolgono l'adesione cellula-matrice (ad esempio, la mieloperossidasi e altri ossidanti matrice-modifica / enzimi rilasciati durante l'infiammazione) sono implicati nella innescare cambiamenti patologici in funzione cellulare, fenotipo e la vitalità in una serie di malattie. Qui, descriviamo come impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo possono essere facilmente impiegati per quantificare con precisione i cambiamenti in tempo reale di adesione cellulare e de-adesione indotta da modifiche alla matrice (utilizzando cellule endoteliali e la mieloperossidasi come stimolo matrice modificando fisiopatologico) con alta risoluzione temporale e in modo non invasivo. Il sistema di impedenza della cella-substrato xCELLigence quantifica continuamente la zona di adesione cellula-matrice misurando l'impedenza elettrica all'interfaccia cellula-substrato in cellule cresciute su array di microelettrodi oro. L'analisi delle immagini di time-lapse differenziale film contrasto interferenze quantifica variazione dell'area proiettata di singole cellule nel tempo, rappresentano variazioni dell'area di contatto cellula-matrice. Entrambe le tecniche quantificare con precisione rapidi cambiamenti dei processi di adesione cellulare e de-adesione. Impedenza Cell-substrato su array microelettrodo biosensori fornisce una piattaforma per le misure robusta, ad alta produttività. Imaging cellulare dal vivo analizza fornire ulteriori dettagli circa la natura e la dinamica dei cambiamenti morfologici quantificati da misure di impedenza cella-substrato. Questi approcci complementari forniscono nuove preziose intuizioni come mieloperossidasi-catalizzata ossidativo modifica dei componenti della matrice extracellulare subcellulari innesca rapidi cambiamenti di adesione cellulare, la morfologia e di segnalazione nelle cellule endoteliali. Questi approcci sono applicabili per studiare dinamiche di adesione cellulare in risposta ad altri stimoli matrice modificanti e in cellule aderenti correlate (ad esempio, cellule epiteliali) anche.
Introduction
Contatti adesivi stabili tra le cellule e la loro matrice extracellulare che circonda sono necessari per mantenere l'omeostasi tissutale. Per esempio, l'adesione delle cellule endoteliali alla matrice sottoendoteliale nei vasi sanguigni gioca un ruolo critico nel mantenere l'integrità dello strato endoteliale e la sua funzione omeostatica come normativo, semi-permeabile barriera vascolare 1. Il citoscheletro actina è accoppiato meccanicamente ad adesivo molecole della matrice in siti di adesione cellula-matrice e contatti adesivo all'interfaccia cellula-matrice svolgere un ruolo importante nel determinare la posizione della membrana cellulare resistendo centralmente dirette forze di trazione actomiosina. Stimoli extracellulari che alterano l'adesione cellula-matrice necessariamente alterare l'equilibrio delle forze all'interfaccia cellula-matrice, un evento che è rapidamente 'percepite' di proteine di segnalazione meccano-sensibili, causando la trasduzione di "outside-in di segnalazione". Questa scommessa cross-talkcellule Ween e la loro matrice extracellulare che circonda svolge un ruolo chiave nel controllo la forma delle cellule, la motilità, la funzione, la proliferazione e la sopravvivenza 2.
Processi patofisiologici Varie (sviluppo embrionale, infiammazione, riparazione delle ferite e le metastasi del cancro) sono caratterizzati da rimodellamento dinamico di substrati matrice adesivo ossidanti e / o enzimi 3,4 matrice-degradanti. Ad esempio, proteine della matrice adesiva subendoteliali nei vasi sanguigni (es, fibronectina) sono implicati come obiettivi principali per la modifica o la degradazione in malattie infiammatorie umane a causa della produzione localizzata di ossidanti reattivi (per esempio, acido ipocloroso, HOCl) dall'enzima leucociti derivato mieloperossidasi (MPO), che si accumula all'interno del subendothelium durante malattia vascolare infiammatoria (Figura 1) 5-9. Variazioni di adesione cellula-matrice indotte da ossidanti MPO-derivati e altri stimoli matrice-modifica sono likely a giocare un ruolo importante nel modificare l'omeostasi vascolare durante una varietà di processi patologici, ad esempio, alterando la segnalazione delle cellule endoteliali, la morfologia e la vitalità, che a sua volta perturba funzione endoteliale e integrità della barriera. Tuttavia, le risposte di segnalazione morfologiche e cellulari delle cellule aderenti a modifiche della matrice extracellulare stanno solo iniziando a essere capito.
Per capire come le modifiche di matrice auto cambiamenti nelle dinamiche di adesione cellulare e delle cellule vie di segnalazione di adesione-dipendente, le tecniche, sono necessari a quantificare con precisione i cambiamenti in adesione cellula-matrice in tempo reale, con alta risoluzione temporale. Qui, descriviamo complementare impedenza cell-substrato e tecniche di imaging cellulare dal vivo che soddisfano questi criteri e fornire una piattaforma per quantificare l'adesione delle cellule e dei processi di de-adesione in modo non invasivo.
Mostriamo come questi impedenza della cella-substrato e vivo appro imaging cellularedolori possono essere facilmente impiegati per (i) monitorare le dinamiche di attaccamento cellulare e diffusione (cioè, de novo adesione cellulare) su substrati matrice nativi e modificati e (ii) per misurare le dinamiche di distacco cellula-matrice (cioè, de-aderenza ) da parte delle cellule aderenti esposte a stimoli matrice-modifica. Il sistema xCELLigence cellula-substrato biosensore impedenza fornisce una misurazione continua della superficie di contatto cellula-matrice quantificando impedenza elettrica alla superficie 96 pozzetti array oro microelettrodi ed esprime queste misurazioni dell'impedenza elettrici come 'indice di cellule', un valore adimensionale che è sostanzialmente proporzionale all'area di cellula-substrato contatto 10 (figura 2), mentre anche essendo sensibile alle variazioni della distanza media tra la (isolante) membrana cellulare e la superficie dell'elettrodo 11. Un ulteriore aumento dei valori di indice cella è ottenuta anche sulla formazione di stretto contatto cellula-cellula that limitare i flussi di corrente paracellulare, 11 condizioni che non prevalgono nei esperimenti descritti in questo studio. Misurazione della superficie proiettata delle singole cellule nel tempo per l'analisi delle immagini di time-lapse contrasto di interferenza differenziale (DIC) film fornisce una misura complementare di variazioni dell'area di contatto cellula-substrato e fornisce ulteriori informazioni sulla natura esatta e la dinamica del cambiamenti morfologici quantificati dall'approccio impedenza cellula-substrato.
In particolare, si descrive l'applicazione di questi approcci per monitorare come ossidazione delle proteine della matrice subendoteliale adesivi (ad esempio, fibronectina) (i) MPO-mediata riduce l'adesione de novo di cellule endoteliali sospese su fibronectina purificato e (ii) innesca cellula-matrice de -adhesion in cellule endoteliali, con l'adesione stabilito sulla fibronectina. Eseguendo segnalazione cellulare parallela analisi nel tempo utilizzando biochem rilevantesaggi iCal (ad esempio, blotting occidentale), le relazioni temporali e causali tra i processi di adesione / de-adesione e cambiamenti associati nella segnalazione cellulare eventi adesione-dipendente può essere determinato.
Questi approcci sono stati recentemente utilizzati per dimostrare che l'ossidazione della matrice extracellulare catalizzata da depositi subendoteliali di MPO innesca una rapida perdita di adesione cellula-matrice delle cellule endoteliali che è guidato da preesistenti forze actomiosina contrattili 9. È importante sottolineare che, consentendo la relazione temporale tra cambiamenti sia adesione delle cellule e delle cellule di adesione-dipendente di segnalazione da stabilirsi, questi approcci identificati che modifica matrice MPO-indotta e cellulare de-adesione innesca cambiamenti di importanti vie di segnalazione delle cellule adesione-dipendente tra cui Src chinasi -dipendente fosforilazione paxillina e leggera della miosina catena II fosforilazione (Figura 1) 9. Questa modalità di segnalazione redox-dipendente, involving l'attivazione di eventi di segnalazione intracellulare da reazioni ossidative extracellulari che inficiano l'adesione cellula-matrice, rappresenta una nuova modalità di segnalazione cellulare denominato "fuori-nella segnalazione redox" (Figura 1) 9.
In generale, questi complementare biosensore impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo dovrebbero essere utili nel rivelare come i diversi stimoli o agenti matrice-modificando auto cambiamenti nelle dinamiche di adesione cellulare, morfologia e segnalazione all'interno di diversi tipi di cellule aderenti soggette a una vasta gamma di impostazioni sperimentali.
Il protocollo segue descrive come quantificare l'impatto di ossidazione matrice MPO-mediata su de novo di adesione delle cellule endoteliali (Esperimento 1) e cellule endoteliali de-adesione (Esperimento 2) processi. MPO lega avidamente alla fibronectina e altre proteine della matrice extracellulare subendoteliali adesivi e cies perossido di idrogeno (H 2 O 2) per convertire ioni cloruro (Cl -) al altamente reattivo clorurante ossidante acido ipocloroso (HOCl), che reagisce localmente con queste proteine della matrice e disturba le loro proprietà adesive delle cellule (Figura 1) 8,9, 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adesione cellula-matrice e processi de-adesione possono essere quantificati con precisione in tempo reale ad alta risoluzione temporale con impedenza di cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci in tempo reale forniscono un grande vantaggio rispetto end-point analisi di adesione cellulare, che offrono scarsa risoluzione temporale. Per quantificare con precisione le risposte de-adesione rapide con alta risoluzione temporale, queste analisi possono fornire spunti critici in modalità morfolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
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