Makrofag Kolesterol Utarmning och dess effekt på Fagocytos av<em> Cryptococcus neoformans</em

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

Kryptokockos är en livshotande infektion som orsakas av patogena svampar av släktet Cryptococcus. Infektion sker vid inandning av sporer, vilka är i stånd att replikera i den djupa lungan. Fagocytos av Cryptococcus av makrofager är ett av de sätt som sjukdomen är i stånd att sprida sig in i det centrala nervsystemet för att orsaka dödlig meningoencefalit. Därför är det viktigt att förstå utvecklingen av infektionen studie av sambandet mellan Cryptococcus och makrofager. Den aktuella studien beskriver en steg-för-steg-protokoll för att studera makrofag smitt av C. neoformans in vitro. Med hjälp av detta protokoll, studeras betydelsen av värd steroler värd och patogen interaktioner. Olika koncentrationer av metyl – cyklodextrin (MCD) användes för att utarma kolesterol från murin retiklet sarkom makrofagliknande cellinjen J774A.1. Kolesterol utarmning bekräftades och kvantifierades med både ett kommersiellt tillgänglig före kolesterol kvantifiering kit och tunnskiktskromatografi. Kolesterol utarmat celler aktiveras med Lipopolysacharide (LPS) och interferon gamma (IFNy) och infekterade med antikropps opsoniserad Cryptococcus neoformans vildtyp H99 celler vid en förhållande effektor-till-mål på 1: 1. Infekterade celler övervakades efter 2 h av inkubation med C. neoformans och deras fagocytiska index beräknades. Kolesterol utarmning resulterade i en signifikant minskning av den fagocytiska indexet. De presenterade protokollen erbjuder en bekväm metod för att efterlikna initieringen av infektionsprocessen i laboratoriemiljö och studera rollen av värd lipidsammansättningen på smittsamhet.

Introduction

Fagocytos är en process genom vilken extracellulära enheter internaliseras av värdceller. Det är ett viktigt vapen i immunsystemets arsenal för att försvara sig mot patogener, men processen kan ofta undermineras av patogener för att möjliggöra internalisering och spridning i hela kroppen ^1. Fagocytos medieras av flera signaleringshändelser som resulterar i fastsättning och omvälvning via omlagringar i värdcellens cytoskelettet. "Professionella" fagocyter kan känna igen och binda till opsoniner på ytan av den invaderande patogen för att signalera för fastsättning och bildandet av lamellipodia, som uppsluka patogenen och bildar en phagosome ^2. Bland de så kallade "professionella" fagocyter är makrofager. Makrofager är högt specialiserade celler som utför skyddsfunktioner som inkluderar söka upp och eliminera sjukdomsframkallande ämnen, reparera skadade vävnader, och medla inflammation, de flesta avdessa genom processen för fagocytos ^1,2.

Cryptococcus neoformans är en art av patogen jäst som orsakar en allvarlig sjukdom som kallas kryptokockos. Cryptococcus sporer inandning av värden och resultera i en lunginfektion som vanligtvis asymtomatisk. Man tror att exponeringen är extremt utbredd; ett urval av 61 barn från Pediatric Infectious Diseases kliniken vid Bronx-Libanon Hospital Center fann att alla tillfrågade dem hade antikroppar mot cryptococcal polysackarid glucuronoxylomannan och andra studier har visat förekomst i både humant immunbristvirus (hiv) oinfekterade och infekterade vuxna ^{3, 4.} alveolära makrofager är den första raden i svar på den lunginfektion och i de flesta fall lyckas klara patogenen. Men med nedsatt immunförsvar (t.ex., HIV och AIDS patienter) jästen kan överleva inom makrofager. I dessafall kan makrofagerna fungera som en nisch för replikering av den patogen och kan underlätta dess spridning till det centrala nervsystemet (CNS) där sjukdomen blir dödlig ^5-8. Man tror att makrofager ens kan leverera jästen direkt i mening, hjälpa jästen att passera blod-hjärnbarriären via "trojansk häst" modell ^{3,9 – 11.} Således är det viktigt att förstå processen för fagocytos och de faktorer som påverkar det, särskilt i kryptokockinfektioner.

Tidigare arbete i andra patogener system pekar på kolesterol och lipidaggregat bildade av kolesterol som har en viktig roll att spela i fagocytos ^12-15. Kolesterol är den mest förekommande lipidförening i däggdjursceller och innefattar 25-50% av däggdjurscellmembranet ^16. Det har visat sig spela en roll vid modulering BlOPhysical egenskaper membran genom att ändra sin styvhet ^17. Kolesterol och sfingolipider tillsammans bildar lipid mikro inom membranet kallas lipidaggregat. Lipidaggregat har befunnits vara inblandade i bildandet av caveolae, samt att ge en isolerad domän för vissa typer av signalering ^16-18. På grund av deras ringa storlek, är det svårt att studera lipidaggregat in vivo. Ett bra sätt att studera rollen av lipidaggregat är att ändra sina väljare. Metyl-β-cyklodextrin (MβCD) är en förening som har visat att tömma kolesterol från däggdjurs membran och används ofta för att studera vilken roll lipidaggregat ^18.

I detta protokoll presenterar vi en metod för att utarma kolesterol från värdcellmembran och kvantifiera effekten av utarmning på förmågan hos värdcellerna att fagocytera C. neoformans in vitro. Denna procedur använder sig av cellodlings techniqderingar på en odödlig makrofagliknande cellinje (J774A.1) som en modell för infektion. Kolesterol utarmning åstadkoms genom exponering för MβCD, som har en hydrofob kärna är specifik för den storleken av steroler och är i stånd att fungera som en sänka för kolesterol för att dra den ut ur membranet ^19. Kolesterol utarmning mättes kvantitativt med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit och kvalitativt med hjälp av en modifierad Bligh-Dyer lipidextraktion följt av tunnskiktskromatografi (TLC) ^20. . Fagocytos mättes genom att infektera cellen linje med en kultur av opsoniserad jäst blandat med en cocktail av interferon-γ och lipopolysackarid för aktivering av makrofager Cryptococcus ades opsoniserad med hjälp av en glucuronoxylomannan (GXM) antikropp ^21-23. Färgning och mikroskopi experiment tillåtet för visualisering av cellerna och beräkning av fagocytiska index för att bedöma graden av fagocytos. Sammantaget detta protokoll describes en grundläggande metod som integrerar förändringen av lipidkompositionen med en fysiologisk process.

Protocol

1. Kolesterol Utarmning av J774A.1 Celler med MβCD I en steril biosäkerhet skåp, utsädes 10 5 J774A.1 makrofagliknande celler per brunn på en 96-brunnars cellodlingsplatta i 200 | il Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (P / S). Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 O / N. Ta ut mediet från cellmonolagret och tvätta cellerna två gånger med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som har filtre…

Representative Results

Kolesterol Depletion Analys av supernatanten reserverad i steg 1.3 i protokollet genom att följa tillverkarens anvisningar i Amplex Red Kolesterol Assay kit ger en förhöjd koncentration av kolesterol i MβCD behandlade provet jämfört med 1x PBS kontroll. Beroende på celltyp och MβCD koncentration används kolesterol utarmning kan variera. För J774 behandlades med 10 mM MβCD ades en utarmning av ca 50% observerats. Utarmning kan beräknas med användning av värden erhållna från super…

Discussion

I arbetet med detta protokoll är det viktigt att få exakta celltal vid plätering däggdjursceller och opsoniserande C. neoformans celler. Detta minimerar variationen mellan försöken och säkerställer en exakt 1: 1 målet till effektor-förhållande under hela studien. Det är också viktigt att samordna tidpunkten för kolesterol utarmning och infektion för att förhindra de opsoniserad jästceller eller behandlade makrofagceller från vila vid RT mellan förfarandena. Långa väntetider kan leda till f?…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Class II type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	3460009
J774A.1 cell line	ATCC	TIB-67	Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus	Gibco	10082-147	Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator	Fisher Scientific		Model # 3530
96-Well culture dish	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-Cyclodextrin	Sigma Life Science	C4555-10G	Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations
Orbital Shaker	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molecular Probes	A12216	All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax microplate reader	Molecular Devices		Model F5
TLC Chamber	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498-4L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Paper	Whatman	3030917	Cut down to size needed for TLC tank
Fume Hood			Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards
6-Well Plate	Corning Inc. Costar	3506
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Cell Scraper	Corning Inc. Costar	3010
Hemocytometer	Hausser Scientific	1490
Centrifuge	Beckman Coulter		Model Alegra x-30R
Votex Mixer	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Model # MS104S Meaures down to .1 mg
Glass Pasteur Pipette	Fisherbrand	13-678-20A
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000
SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific		Model # SPD2010
Petroleum Ether	Fisher Scientific	E139-1
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	309966
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
Iodine Chips	Sigma-Aldrich	376558-50G
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	320501
Manganese Chloride	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging System	Ultra-Violet Products Ltd.		Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass Bottom Confocal Dish	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Obtained from Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide	Sigma	L4391-1MG	Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma	Sigma	I4777	Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)			Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL
Giemsa	MP Biomedicals	194591	Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope	Zeiss		Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images