In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.
Kryptokockos är en livshotande infektion som orsakas av patogena svampar av släktet Cryptococcus. Infektion sker vid inandning av sporer, vilka är i stånd att replikera i den djupa lungan. Fagocytos av Cryptococcus av makrofager är ett av de sätt som sjukdomen är i stånd att sprida sig in i det centrala nervsystemet för att orsaka dödlig meningoencefalit. Därför är det viktigt att förstå utvecklingen av infektionen studie av sambandet mellan Cryptococcus och makrofager. Den aktuella studien beskriver en steg-för-steg-protokoll för att studera makrofag smitt av C. neoformans in vitro. Med hjälp av detta protokoll, studeras betydelsen av värd steroler värd och patogen interaktioner. Olika koncentrationer av metyl – cyklodextrin (MCD) användes för att utarma kolesterol från murin retiklet sarkom makrofagliknande cellinjen J774A.1. Kolesterol utarmning bekräftades och kvantifierades med både ett kommersiellt tillgänglig före kolesterol kvantifiering kit och tunnskiktskromatografi. Kolesterol utarmat celler aktiveras med Lipopolysacharide (LPS) och interferon gamma (IFNy) och infekterade med antikropps opsoniserad Cryptococcus neoformans vildtyp H99 celler vid en förhållande effektor-till-mål på 1: 1. Infekterade celler övervakades efter 2 h av inkubation med C. neoformans och deras fagocytiska index beräknades. Kolesterol utarmning resulterade i en signifikant minskning av den fagocytiska indexet. De presenterade protokollen erbjuder en bekväm metod för att efterlikna initieringen av infektionsprocessen i laboratoriemiljö och studera rollen av värd lipidsammansättningen på smittsamhet.
Fagocytos är en process genom vilken extracellulära enheter internaliseras av värdceller. Det är ett viktigt vapen i immunsystemets arsenal för att försvara sig mot patogener, men processen kan ofta undermineras av patogener för att möjliggöra internalisering och spridning i hela kroppen 1. Fagocytos medieras av flera signaleringshändelser som resulterar i fastsättning och omvälvning via omlagringar i värdcellens cytoskelettet. "Professionella" fagocyter kan känna igen och binda till opsoniner på ytan av den invaderande patogen för att signalera för fastsättning och bildandet av lamellipodia, som uppsluka patogenen och bildar en phagosome 2. Bland de så kallade "professionella" fagocyter är makrofager. Makrofager är högt specialiserade celler som utför skyddsfunktioner som inkluderar söka upp och eliminera sjukdomsframkallande ämnen, reparera skadade vävnader, och medla inflammation, de flesta avdessa genom processen för fagocytos 1,2.
Cryptococcus neoformans är en art av patogen jäst som orsakar en allvarlig sjukdom som kallas kryptokockos. Cryptococcus sporer inandning av värden och resultera i en lunginfektion som vanligtvis asymtomatisk. Man tror att exponeringen är extremt utbredd; ett urval av 61 barn från Pediatric Infectious Diseases kliniken vid Bronx-Libanon Hospital Center fann att alla tillfrågade dem hade antikroppar mot cryptococcal polysackarid glucuronoxylomannan och andra studier har visat förekomst i både humant immunbristvirus (hiv) oinfekterade och infekterade vuxna 3, 4. alveolära makrofager är den första raden i svar på den lunginfektion och i de flesta fall lyckas klara patogenen. Men med nedsatt immunförsvar (t.ex., HIV och AIDS patienter) jästen kan överleva inom makrofager. I dessafall kan makrofagerna fungera som en nisch för replikering av den patogen och kan underlätta dess spridning till det centrala nervsystemet (CNS) där sjukdomen blir dödlig 5-8. Man tror att makrofager ens kan leverera jästen direkt i mening, hjälpa jästen att passera blod-hjärnbarriären via "trojansk häst" modell 3,9 – 11. Således är det viktigt att förstå processen för fagocytos och de faktorer som påverkar det, särskilt i kryptokockinfektioner.
Tidigare arbete i andra patogener system pekar på kolesterol och lipidaggregat bildade av kolesterol som har en viktig roll att spela i fagocytos 12-15. Kolesterol är den mest förekommande lipidförening i däggdjursceller och innefattar 25-50% av däggdjurscellmembranet 16. Det har visat sig spela en roll vid modulering BlOPhysical egenskaper membran genom att ändra sin styvhet 17. Kolesterol och sfingolipider tillsammans bildar lipid mikro inom membranet kallas lipidaggregat. Lipidaggregat har befunnits vara inblandade i bildandet av caveolae, samt att ge en isolerad domän för vissa typer av signalering 16-18. På grund av deras ringa storlek, är det svårt att studera lipidaggregat in vivo. Ett bra sätt att studera rollen av lipidaggregat är att ändra sina väljare. Metyl-β-cyklodextrin (MβCD) är en förening som har visat att tömma kolesterol från däggdjurs membran och används ofta för att studera vilken roll lipidaggregat 18.
I detta protokoll presenterar vi en metod för att utarma kolesterol från värdcellmembran och kvantifiera effekten av utarmning på förmågan hos värdcellerna att fagocytera C. neoformans in vitro. Denna procedur använder sig av cellodlings techniqderingar på en odödlig makrofagliknande cellinje (J774A.1) som en modell för infektion. Kolesterol utarmning åstadkoms genom exponering för MβCD, som har en hydrofob kärna är specifik för den storleken av steroler och är i stånd att fungera som en sänka för kolesterol för att dra den ut ur membranet 19. Kolesterol utarmning mättes kvantitativt med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit och kvalitativt med hjälp av en modifierad Bligh-Dyer lipidextraktion följt av tunnskiktskromatografi (TLC) 20. . Fagocytos mättes genom att infektera cellen linje med en kultur av opsoniserad jäst blandat med en cocktail av interferon-γ och lipopolysackarid för aktivering av makrofager Cryptococcus ades opsoniserad med hjälp av en glucuronoxylomannan (GXM) antikropp 21-23. Färgning och mikroskopi experiment tillåtet för visualisering av cellerna och beräkning av fagocytiska index för att bedöma graden av fagocytos. Sammantaget detta protokoll describes en grundläggande metod som integrerar förändringen av lipidkompositionen med en fysiologisk process.
I arbetet med detta protokoll är det viktigt att få exakta celltal vid plätering däggdjursceller och opsoniserande C. neoformans celler. Detta minimerar variationen mellan försöken och säkerställer en exakt 1: 1 målet till effektor-förhållande under hela studien. Det är också viktigt att samordna tidpunkten för kolesterol utarmning och infektion för att förhindra de opsoniserad jästceller eller behandlade makrofagceller från vila vid RT mellan förfarandena. Långa väntetider kan leda till f?…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH bidrag AI56168, AI71142, AI87541 och AI100631 till MDP. Maurizio Del Poeta är Burroughs Wellcome Investigator i infektionssjukdomar.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
Methyl-β-Cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations |
Orbital Shaker | Labline | ||
Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
TLC Chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
Fume Hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
6-Well Plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
Cell Scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
Votex Mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S Meaures down to .1 mg | |
Glass Pasteur Pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
Petroleum Ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
Iodine Chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
Manganese Chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
Glass Bottom Confocal Dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L. |
Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C. |
Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution |
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL | ||
Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |