선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em> 예쁜 꼬마 선충</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
우리의 환경에 존재하는 화학 물질의 수천의 생식 독성을 확인하는 것은 환경 보건 분야에서 가장 밝히는 과제 중 하나가되었습니다. 이것은 척추 동물의 높은 번호를 필요로하지 않고, (1) 정확하게 (2) 높은 처리량 방식으로 중간에서 이렇게 생식 과정 키 기능 요점을 되풀이하고있다 모델 시스템의 소수에 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다.
우리는 선충 C. 여기에 분석을 설명 aneuploid 배아의 유도를 모니터링하여 생식 세포 독성 물질의 신속한 식별 할 수 간스. GFP 리포터 라인을 이용하여, 배아 파괴로 인한 염색체 분리에 오차가 용이하게 시각화 및 자동화 된 형광 현미경에 의해 정량화. 따라서, 그 독성에 대한 화합물의 특정 세트의 스크리닝은 수일 384 96- 웰 플레이트 형식으로 수행 될 수있다. 긍정적 인 시간의 차 분석그는 염색체 이상은 감수 분열 또는 초기 배아 염색체 분리에 유래 오류 여부를 판단하기 위해 수행 될 수있다. 전부,이 분석 결과 화학 물질에의 노출 다음과 생식 기능 장애의 신속한 평가를위한 빠른 첫 번째 패스 전략을 나타냅니다.
Introduction
미국에서 상업에 등록 된 약 87,000 화학 물질이이 건강에 미치는 영향 1 테스트 한의 또 적은 수 있습니다. 테스트 한 것들 중에서 일부만 특히 여성 생식 세포 발생과 분화 동안 포유류 이른 생식 이벤트의 변경을 결정하는데 어려움으로 인해 일부 생식 건강에 미치는 영향에 대해 평가되었다. 사실, 첫 번째 감수 이벤트는 여성 포유 동물의 배아 발달의 초기 단계 동안 자리를 차지할 때문에 액세스 및 심사 목적에 맞는 숫자를 수집하기가 어렵습니다.
생식 세포는 세대 간의 중요한 연결을 제공하고, 그것의 적절한 기능은 세포의 염색체 분열의 복잡한 프로그램의 정확한 실행이 감수 분열이라에 따라 달라집니다. 감수 과정의 조절 곤란 저감 다산 및 생산 될 수있다염색체의 이상 수의 생식 세포 및 배아는 조건 이수성 불린다. 감수 분열 염색체 편석 에러는 인간의 건강에 매우 적합하다. 염색체 이상은 1 (150) 출산의 주파수, 삼 염색체 21, 18, 13뿐만 아니라 가장 흔한 유형 2,3 인 X와 Y 염색체 오류, 일반적이다. 또한, 염색체의 기원을 포함한 선천성 기형이, 미국 4 환경의 영향이 염색체 분리와 행동에 영향을 미칠 수 있다는 생각 유아 사망의 주요 원인이되는 5 개의 새로운 것이 아니다,하지만 여전히 제대로 이해된다. 그것은 인간의 불임, 초기 개발 및 전반적인 생식 건강을 방해 우리의 환경에 도입 된 화학 물질의 어떤 조사하는 것이 중요하다.
포유 동물 모델의 이러한 한계의 관점에서, 우리는 <회충 생식 독성을 테스트하기 위해 높은 처리량 스크린 분석법을 개발EM> C. 엘레. 우리는 작은 크기, 낮은 비용, 짧은 재생주기, 생식 세포의 비율이 높은 및 조작 (6)의 용이성으로이 일반적으로 사용되는 유전자 모델 시스템에서 제공하는 여러 가지 중요한 기능을 동원했다. 웜 96- 웰 플레이트 또는 대량의 액체 배양 물에서 성장 될 수 있고, 투명성 때문에 직접 형광 리포터 검출 용 플레이트 상에 이미징 될 수있다. 후술 분석은 이러한 특성을 활용하고 및 배아 생식 세포 분열 이수성의 유도를 검출하는 형광 리포터에게 Pxol :: GFP-1을 함유하는 웜 변형을 이용한다.
이 리포터 균주의 사용은 주로 암수 웜 인구 남성 일반적 드문에 기초한다. 이 남성은 (<0.2 %)이 자연스럽게 X 염색체 7의 분리에 오류를 발생. 그러나 생식 세포 분열로 자주 염색체의 분리의 오류로 연결과 heterochromosomes, 그것은 남성의 표현형 (X의 missegregation)뿐만 아니라 배아 치사 (염색체의 missegregation)의 높은 발병률을 모두 상관 관계. 배아 치사의 문제를 회피하면서 쉽게 수컷의 유도를 검출하기 위해, 남성 특이 프로모터 (XOL-1) 여전히 웜의 자궁 내에 포함 된 초기 배아에서 GFP의 발현을 구동하는 데 사용된다. 이와 같이, GFP 발현의 배아 외관 aneuploid 배아의 존재에 대한 프록시로서 사용된다. 이 방법은 이전 생식계 정비 및 감수 8,9에 관여 유전자를 동정하는데 사용되어왔다. 화학적 선별하도록 구성된,이 균주는 높은 처리량 스크린 매체에 사용된다. 중요한 것은, 변형 충실 화학 물질의 aneugenicity를보고하고 포유 동물의 생식 엔드 포인트 (10)에 따라서 관련이있다. 여기에 설명 된 분석은보고 제약 및 화학 산업 설정에서 독성 학자들에게 특히 유용 할 것입니다빠르게 생식 엔드 포인트에 대한 화학 물질의 독성을 평가합니다. 또한,이 분석은 완전히 21 세기 보고서 11 독성에 강조 정부의 우선 순위로 정렬합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 기재된 방법은 생식선 독성의 식별을위한 제 대규모 전략을 구성한다. 그것은 충실하게 생식 기능 장애에 대한 프록시로 사용되는 초기 배아에서 이수성의 유도를보고 GFP 형질 전환 Pxol-1 :: GFP 포함하는 변형의 사용을 필요로한다. 방법 C. 동기화의주의를 포함 엘레 웜 인구와 자동화 된 고 함량 현미경으로 GFP 긍정적 인 웜의 영상 다음 96 웰 형식의 화학 물질에 웜 '…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
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