Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
La identificación de la toxicidad para la reproducción de los miles de productos químicos presentes en el medio ambiente ha sido uno de los retos más tentadoras en el campo de la salud ambiental. Esto se debe en parte a la escasez de sistemas de modelos que pueden (1) recapitular precisión claves características de los procesos reproductivos y (2) lo hacen de una a medio y forma de alto rendimiento, sin la necesidad de un alto número de animales vertebrados.
Se describe aquí un ensayo en el nematodo C. elegans que permite la rápida identificación de sustancias tóxicas de la línea germinal mediante el control de la inducción de embriones aneuploides. Al hacer uso de una línea reportero GFP, los errores en la segregación cromosómica resultante de la interrupción de la línea germinal son fácilmente visualizaron y cuantificaron por microscopía de fluorescencia automatizado. Así, la proyección de un conjunto particular de compuestos para su toxicidad se puede realizar en un formato de placa de 96 a 384 pocillos en cuestión de días. El análisis secundario de h positivosu se puede realizar para determinar si las anomalías cromosómicas se originaron de interrupción meiótica o desde los primeros errores segregación cromosómica embrionarias. En total, este ensayo representa una estrategia de primer paso rápido para la evaluación rápida de la disfunción de la línea germinal después de la exposición química.
Introduction
Hay aproximadamente 87.000 productos químicos registrados para el comercio en los Estados Unidos, sin embargo, sólo un pequeño número de ellos han sido probados para potenciales efectos sobre la salud 1. De los que han sido probados, sólo una parte se ha evaluado para los efectos de salud reproductiva debido en parte a la dificultad en la determinación de la alteración de los primeros eventos reproductivos en mamíferos, especialmente durante el desarrollo de células germinales femeninas y la diferenciación. De hecho, los primeros eventos meióticos tienen lugar durante las primeras etapas del desarrollo embrionario en mamíferos hembras y son, por tanto, de difícil acceso y recoger en números adecuados para fines de selección.
La línea germinal proporciona el vínculo crucial entre las generaciones, y su función apropiada depende de la precisa ejecución del programa intrincado de la división celular y cromosómica denomina meiosis. La disregulación del proceso de meiótica puede resultar en la reducción de la fertilidad y la producción degametos y embriones con un número anormal de cromosomas, una condición denominada aneuploidía. Errores de segregación de cromosomas en la meiosis son muy importantes para la salud humana. Las anomalías cromosómicas son comunes, con una frecuencia de 1 de cada 150 nacidos vivos, la trisomía 21, 18 y 13, así como X e Y los errores cromosómicos son los tipos más frecuentes 2,3. Por otra parte, las malformaciones congénitas, incluidas las de origen cromosómico, son la principal causa de muerte infantil en los EE.UU. 4 La idea de que las influencias ambientales pueden afectar la segregación cromosómica y el comportamiento no es nuevo 5, pero aún es poco conocido. Por tanto, es fundamental investigar cuál de los productos químicos introducidos en nuestro entorno están interfiriendo con la fertilidad humana, el desarrollo temprano y la salud reproductiva en general.
A la luz de estas limitaciones de los modelos de mamíferos, hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento pantalla para probar la toxicidad reproductiva en la lombriz <em> C. elegans. Hemos movilizado a varias características importantes que ofrece este sistema modelo genético de uso común, como su pequeño tamaño, bajo coste, ciclo de reproducción corto, alta proporción de células germinales y la facilidad de manipulación 6. Los gusanos pueden ser cultivadas en placas de 96 pocillos o en cultivos líquidos de alto volumen y por su transparencia se pueden visualizar directamente en placas para la detección de los reporteros fluorescentes. El ensayo descrito a continuación se aprovecha de estas características y se aprovecha de una cepa de gusano que contiene el indicador fluorescente Pxol-1 :: GFP para detectar la interrupción de la línea germinal y la inducción de aneuploidía embrionario.
El uso de esta cepa reportero se basa generalmente en la rara aparición de machos en una población de gusanos principalmente hermafrodita. Estos machos (<0,2%) se originan naturalmente de error en la segregación del cromosoma X 7. Sin embargo, como la interrupción de la línea germinal conduce con frecuencia a errores en la segregación de los autosomasy de heterocromosomas, que se correlaciona tanto con una incidencia elevada de machos fenotipo (X missegregation), así como la letalidad embrionaria (missegregation autosoma). Para detectar fácilmente la inducción de hombres, mientras que eludir el problema de la letalidad embrionaria, un promotor específico masculino (Xol-1) se utiliza para conducir la expresión de GFP en embriones tempranos todavía contenidos dentro del útero de la gusano. Como tal, la aparición de embriones que expresan GFP se utiliza como un indicador de la presencia de embriones aneuploides. Este método ha sido utilizado anteriormente para identificar genes implicados en el mantenimiento de la línea germinal y 8,9 meiosis. Adaptado a la detección química, esta cepa se emplea en un medio de pantalla de alto rendimiento. Es importante destacar que la cepa informa fielmente el aneugenicidad de productos químicos y es, por tanto, relevante para puntos finales reproductivos de mamíferos 10. El ensayo descrito aquí será particularmente útil para toxicólogos en entornos de la industria farmacéutica y química que buscanpara evaluar rápidamente la toxicidad de los productos químicos hacia los puntos finales reproductivos. Por otra parte, este ensayo se alinea plenamente con las prioridades gubernamentales destacadas en la toxicidad en el 21 informe 11 del siglo XXI.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí constituye la primera estrategia de gran escala para la identificación de sustancias tóxicas de la línea germinal. Se requiere el uso de un transgénico GFP Pxol-1 :: GFP que contiene la cepa que reporta fielmente la inducción de aneuploidía en embriones tempranos que se utiliza como proxy para la disfunción de la línea germinal. El método implica la sincronización cuidadosa de una C. población de gusanos elegans y la exposición a los productos químicos gu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
