Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
Het identificeren van de reproductieve toxiciteit van de duizenden chemische stoffen aanwezig in onze omgeving is een van de meest prikkelende uitdagingen op het gebied van milieu en gezondheid. Dit is deels te wijten aan het gebrek aan modelsystemen dat (1) nauwkeurig kan recapituleren toetsen kenmerken van reproductieve processen en (2) dit doen in een middellange tot high-throughput manier, zonder de noodzaak van een groot aantal gewervelde dieren.
We beschrijven hier een test in de nematode C. elegans dat de snelle identificatie van kiembaan toxische stoffen mogelijk maakt door het monitoren van de inductie van aneuploïde embryo's. Door gebruik van een GFP reporter lijn worden fouten in chromosoomsegregatie gevolg zijn van door kiemlijn verstoring gemakkelijk gevisualiseerd en gekwantificeerd door geautomatiseerde fluorescentie microscopie. Dus de screening van een bepaalde reeks van verbindingen op de toxiciteit kan worden uitgevoerd in een 96- tot 384-well plaat formaat enkele dagen. Secundaire analyse van positieve hhet kan worden uitgevoerd om te bepalen of het chromosoom afwijkingen afkomstig van meiotische verstoring of vroege embryonale chromosoomsegregatie fouten. Al met al, deze test is een snelle first-pass-strategie voor de snelle beoordeling van kiembaan dysfunctie na blootstelling aan chemische stoffen.
Introduction
Er zijn ongeveer 87.000 chemische stoffen geregistreerd voor de handel in de Verenigde Staten, maar slechts een klein aantal van deze zijn getest voor mogelijke gevolgen voor de gezondheid 1. Van degenen die zijn getest, is slechts een deel beoordeeld voor reproductieve gezondheidseffecten deels te wijten aan de moeilijkheid bij het bepalen van de wijziging van de vroege reproductieve gebeurtenissen in zoogdieren, vooral tijdens vrouwelijke ontwikkeling en differentiatie kiemcel. Inderdaad, de eerste meiotische gebeurtenissen plaatsvinden tijdens de vroege stadia van embryonale ontwikkeling bij vrouwelijke zoogdieren en zijn daardoor moeilijk toegankelijk en in een aantal geschikt zijn voor screening doeleinden.
De kiemlijn geeft het cruciale verband tussen generaties, en de gewenste functie is afhankelijk van de precieze uitvoering van de ingewikkelde programma van cellulaire en chromosomale scheiding genoemd meiose. Ontregeling van het meiose kan tot verminderde vruchtbaarheid en de productie vangameten en embryo's met een afwijkend aantal chromosomen, een voorwaarde genoemd aneuploïdie. Chromosoomscheiding fouten in de meiose zeer relevant zijn voor de menselijke gezondheid. Chromosoomafwijkingen komen vaak met een frequentie van 1 in 150 levendgeborenen Trisomie 21, 18 en 13 en X en Y-chromosoom fouten zijn de meest voorkomende vormen 2,3. Bovendien, aangeboren afwijkingen, waaronder die van chromosomale oorsprong, zijn de belangrijkste oorzaak van kindersterfte dood in de VS 4 Het idee dat omgevingsinvloeden chromosomale segregatie en gedrag kunnen beïnvloeden is niet nieuw 5, maar is nog steeds slecht begrepen. Het is daarom van cruciaal belang om te onderzoeken welke van de chemicaliën geïntroduceerd in onze omgeving zijn interfereren met de menselijke vruchtbaarheid, vroege ontwikkeling en de algemene reproductieve gezondheid.
In het licht van deze beperkingen van de zoogdieren modellen, hebben we een high-throughput screen test ontwikkeld tot reproductieve toxiciteit testen in de rondworm <em> C. elegans. We hebben een aantal belangrijke functies van deze veelgebruikte genetisch modelsysteem gemobiliseerd, zoals zijn kleine formaat, lage kosten, korte voortplantingscyclus, hoog percentage van geslachtscellen en het gemak van manipulatie 6. Wormen kunnen worden gekweekt in 96-well platen of hoog volume vloeibare kweken en door hun transparantie direct kan worden afgebeeld op platen voor detectie van fluorescerende reporters. De hieronder beschreven test maakt gebruik van deze eigenschappen en maakt gebruik van een worm stam die de fluorescente reporter Pxol-1 :: GFP kiemlijn verstoring en inductie van embryonale aneuploïdie detecteren.
Het gebruik van deze reporter stam is gebaseerd op de algemeen zeldzaam voorkomen van mannetjes in een hoofdzakelijk hermafrodiete worm bevolking. Deze mannen (<0,2%) van nature afkomstig van fout in de scheiding van het X-chromosoom 7. Aangezien kiemlijn verstoring leidt vaak tot fouten in segregatie autosomenen heterochromosomes, correleert beide met een verhoogde incidentie van mannetjes fenotype (X missegregation) als embryonale letaliteit (autosoom missegregation). Om de inductie van mannetjes gemakkelijk detecteren te omzeilen het vraagstuk van embryonale letaliteit wordt een mannelijk promotor (xol-1) toegepast om expressie van GFP rijden vroege embryo's vertoonden nog in de baarmoeder van de worm. Als zodanig is het uiterlijk van GFP-expressie embryo's gebruikt als een proxy voor de aanwezigheid van aneuploïde embryo's. Deze werkwijze is eerder gebruikt om genen die kiemlijn onderhoud en meiose 8,9 identificeren. Aangepast aan chemische screening, wordt deze stam die werkzaam zijn in een medium tot high-throughput screen. Belangrijk is dat de stam trouw meldt de aneugenicity chemicaliën en daarom relevant voor zoogdieren reproductieve eindpunten 10. De beschreven test is bijzonder nuttig toxicologen in farmaceutische en chemische industrie instellingen uitziendede toxiciteit van chemicaliën naar reproductieve eindpunten snelle beoordeling. Bovendien is deze test volledig in lijn met de bestuurlijke prioriteiten gemarkeerd in de toxiciteit in de ste eeuw rapport 21 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode vormt de eerste grootschalige strategie voor de identificatie van de kiembaan toxische stoffen. Het vereist het gebruik van een GFP transgene Pxol-1 :: GFP bevatten stam die getrouw rapporteert de inductie van aneuploïdie in vroege embryo's wordt gebruikt als een proxy voor kiemlijn dysfunctie. De werkwijze omvat de zorgvuldige synchronisatie van een C. elegans worm bevolking en blootstelling wormen tegen chemicaliën 96 putjes gevolgd door beeldvorming van GFP positieve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
