Supramolekylära hydrogelators baserade på ureido-pyrimidinoner tillåter full kontroll över de makroskopiska gelegenskaperna och sol-gel kopplings beteende med hjälp av pH. Här presenterar vi ett protokoll för att formulera och injicera en sådan supra hydrogelator via en kateter leveranssystem för lokal leverans direkt i relevanta områden i grishjärta.
Regenerering av förlorade hjärtmuskeln är ett viktigt mål för framtida behandlingar på grund av den ökande förekomsten av kronisk ischemisk hjärtsvikt och den begränsade tillgången till donator hjärtan. Ett exempel på en behandling för att återställa funktionen av hjärtat består av lokal tillförsel av läkemedel och bioaktiva substanser från en hydrogel. I detta dokument införs en metod för att formulera och injicera en läkemedelsladdad hydrogel icke-invasivt och sidospecifika in grisen hjärtat med hjälp av en lång, flexibel kateter. Användningen av 3-D elektromekaniska kartläggning och injektion via en kateter tillåter sidospecifik behandling av hjärtmuskeln. För att ge en hydrogel kompatibel med denna kateter, är en supra hydrogel används på grund av den bekväma omkoppling från en gel till en lösning tillstånd att använda miljö triggers. Vid basiskt pH denna ureido-pyrimidinon modifierad poly (etylenglykol) fungerar som en newtonsk vätska som lätt kan injiceras, men vid fysiologiskt pH lösningen växlar snabbt tillen gel. Dessa milda kopplingsförhållandena tillåter inkorporering av bioaktiva läkemedel och biologiskt aktiva substanser, såsom tillväxtfaktorer och exosomes som vi presenterar här i både in vitro och in vivo-experiment. De in vitro experiment ger en på forehand indikation på gelstabilitet och läkemedelsfrisättning, vilket möjliggör avstämning av gel och släpp egenskaper innan den efterföljande ansökan in vivo. Denna kombination gör det möjligt för optimal inställning av gelen till de använda bioaktiva föreningar och art, och insprutningssystemet.
Även behandling av akut hjärtinfarkt har förbättrats avsevärt överlevnad, är kronisk ischemisk hjärtsvikt ett stort folkhälsoproblem som fortskrider med en åldrande befolkning. Det finns cirka 6 miljoner hjärtsviktspatienter i USA med uppskattningsvis 25% ökning av prevalensen år 2030 1,2. Inledande förlust av hjärtmuskelvävnaden leder till hjärt ombyggnad och slutligen orsakar kronisk hjärtsvikt. Med undantag för hjärttransplantation, det finns ingen riktig behandling för denna grupp av patienter. Den ökande bristen på donerade hjärtan betonar behovet av att utveckla nya tillgängliga terapier för att vända denna process av ombyggnad. Därför är ett mål för framtida terapier regenerering av förlorad hjärtmuskeln.
Hydrogeler är intressanta material inom området regenerativ medicin på grund av sin biokompatibilitet, och deras känslighet för externa utlösare 3. Injicerbara hydrogeler har något annonsvantages över icke-injicerbara hydrogeler i deras användning i minimalinvasiv kirurgi 4. Dessa injicerbara hydrogeler kan användas via en spruta på grund av deras Växling inom fysiologiska förhållanden 5, och i princip göra det möjligt för kateterbaserade injektion närmar 6. Olika strategier har använts för injicerbara material, allt från kemisk tvärbindning efter injektion till fysisk tvärbindning genom antingen temperatur, pH och skjuvningsförtunnande beteende 4,7,8. Trots att flera system har visat lätt injicerbarhet via en spruta 9,10, har fullt kateter kompatibilitet inte visats ofta 6.
Hydrogeler framställda av supramolekylära polymerer bildas genom icke-kovalenta interaktioner som kan kopplas enkelt från en gel till en lösning stat, och vice versa med hjälp av miljö utlösare 11. Vidare är de lågmolekylära prekursorer möjliggör enkel bearbetbarhet 12,13 </sup>. De milda betingelser som erfordras för omkoppling tillåta tillägg av olika biologiska aktiva komponenter såsom ofta svåra att hantera tillväxtfaktorer.
Supramolekylära transienta nätverk i vatten baserade på poly (etylenglykol) (PEG), end-modifierad med ureido-pyrimidinon (UPy) -delar 14 har visat fördelarna med icke-kovalenta interaktioner i kombination med biomedicinska tillämpningar och har använts som läkemedelsleveranssystem i hjärtat 6 och under den renala kapseln 15. Dessa nätverk bildas genom dimerisering av UPy grupper avskärmade från vatten miljön genom alkyl distanser som bildar en hydrofob ficka. Urea vätebindningar underlättar efterföljande stapling av dessa dimerer i nanofibrer. På grund av den reversibla interaktion av UPy-UPy dimeren, triggers såsom pH och temperatur kan användas för att växla från lösningar till geler. Användningen av en syntetisk motiv möjliggör utformning av molekylen och gelegenskaperna genom för examenpel tuning längden av PEG-kedjor och alkyl distanser 14,16.
Dessutom kan flera bioaktiva komponenter införlivas genom att helt enkelt blanda den supramolekylära hydrogelator lösning före injektion, med läkemedel eller biologiskt aktiva substanser, såsom tillväxtfaktorer eller exosomer, respektive. Exosomes är små membranvesiklar som innehåller cytosoliska derivat. De utsöndras av många celler och är involverade i intercellulär kommunikation. Exosomes härrör från cardiomyocyte progenitorceller föreslås att spela en roll i hjärtskydd 17.
Här beskriver vi protokoll för formuleringen, och in vivo myocardial injektion av en sådan bioaktiva supra hydrogel. In vitro experiment beskrivs som ger på forehand en indikation på gelstabilitet och läkemedelsfrisättning, vilket möjliggör avstämning av gel och släpp egenskaper innan applikation in vivo.
En viktig utmaning är att få en lösning som är injicerbar genom en lång kateter samtidigt som lösningen är kompatibel med de bioaktiva föreningar. Även om pH-värdet bör höjas för att öka injicerbarheten, bioaktiva föreningar såsom tillväxtfaktorer är ömtåliga molekyler som bör hanteras varsamt. Vi övervakar lösningens pH noga med hjälp av en pH-mätare efter tillsats av hydrogelator att bekräfta att det är pH 9,0 innan du lägger några bioaktiva komponenter. Initialt flera omgångar av justering av utgångs-pH av PBS var nödvändiga för att sluta med rätt pH. Vidare, eftersom vi använder relativt viskösa lösningar och en lång tunn kateter, är ett stort tryckfall närvarande (i storleksordningen 0,5 MPa, beroende på hastigheten av injektionen). Därför bör särskild försiktighet iakttas vid val av rätta kontakterna mellan sprutan och katetern. En sprutpump stöd kontrollerad injektion, som använder sådana krafter för hand är en utmaning. För i VITRo experiment, lösningen gelas genom neutralisering av lösningen med HCl, medan in vivo sker detta genom det naturliga pH-värdet hos vävnaden. Därför är det viktigt att tillsätta rätt mängd HCl för att förhindra en överskjutning av pH. Diffusionen av denna syra är förmodligen den begränsande faktorn i gelning av hydrogelen i försök in vitro; Men in vivo vätskan skulle ha en hög kontaktytan med neutraliserande vävnad, som kommer troligen att resultera i en snabbare och jämnare gelning jämfört med droppvis tillsats av koncentrerad syra. Dessutom är gelén omkopplings mycket snabbare med detta milda förfarande jämfört med tidigare använda metoder (0,5 h vs 2 tim) 25. Använda kroppens naturliga pH för omkoppling av materialegenskaperna är mycket tilltalande eftersom övergången är snabb, reversibel, inte kan uppstå inuti katetern och är in vivo helautomatisk. Dessa egenskaper ger fördelar jämfört med till exempel värme switChable geler 26, där risken för gelning i en kateter följd av temperaturförändringar är närvarande, geler som kräver fotoinducerad polymerisation, vilket är en utmaning på grund av begränsad ljuspenetration och radikalbildning 27 eller geler som kräver co-injektion av en polymerisationsinitiator eller accelerator 28.
Framgångsrik frisättning av ett läkemedel från hydrogelen beror till stor del på storleken av läkemedlet. Som framgår är den lilla molekylen läkemedlet släpps omedelbart medan den gradvisa frisättningen av modellprotein över 1 vecka visar löftet om dessa hydrogeler som leveranssystem för tillväxtfaktorer. I allmänhet, hydrogeler är mer lovande som leveransverktyg för större objekt såsom proteiner, exosomes och celler 29,30.
Den 3-D elektromekaniska kartläggning och injektionsproceduren ger en kliniskt validerad kateterbaserade leverans strategi för olika hjärt regenerativa terapier, såsom hydrogeler. Den added värdet av denna teknik jämfört med andra tekniker icke-kirurgisk leverans är dosplanerings, gör det möjligt att skilja normal, infarkt och ide hjärtmuskeln och att vägleda terapier i området av intresse. Nackdelar med denna metod berör de nödvändiga tekniska kompetens och tidskrävande och dyr procedur 20. I den presenterade grismodell av hjärtinfarkt elektromekaniska kartläggning följdes av guidade intramyocardial injektioner med bioaktiva supramolekylära UPy-hydrogel. Andra kombinationer med regenerativa terapier måste testas in vitro och in vivo att få mer framgång i detta framväxande område. Dessutom har optimering av inmatningsförmåga och steriliseringsprocedurer som ska utföras för att framgångsrikt omsätta denna metod för att en klinisk miljö.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap (Gravity program 024.001.035), Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (NWO), Europeiska forskningsrådet (FP7 / 2007-2013) ERC Bidragsavtal 308.045 och bedrivs inom LSH TKI ram. Denna forskning är en del av projektet P1.03 PENT av forskningsprogrammet för biomedicinska material institutet, som samfinansieras av det nederländska ekonomiministeriet. Projektet stöddes av için – Nederländerna Heart Institute ( www.icin.nl ) och "Wijnand M. Pom Stichting". Författarna vill tacka Henk Janssen och Joris Peters för syntes av UPy-hydrogelator och Remco Arts för att tillhandahålla mRuby2. Vi tackar Bert Meijer, Tonny Bosman, Roxanne Kieltyka, Stijn Kramer, Joost Sluijter, Imo Hoefer och Frebus van Slochteren för många nyttiga diskussioner och Marlijn Jansen, Joyce Visser, Grace Croft och Martijn van Nieuwburg för technical bistånd.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1M HCl | |||
1M NaOH | |||
Polystyrene 24-wells plate | Falcon | 353047 | |
Amiodarone | Cordaron I.V. (Sanofini) | ||
Anton Paar Physica MCR501 | Anton Paar GmbH | Equipped with a parallel-plate geometry (25 mm) | |
Atropine | PCH | ||
Balloon ventilator | |||
Cary 50 Scan UV-Visible Spectrophotometer | Varian | ||
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer | Varian | ||
Defibrillation patches | |||
DMSO | Biosolve | 44705 | |
Endotracheal tube | Covidien | ||
Heparin | |||
Ketamine | Narketan 10 Vétoquinol | ||
Mapping catheter 115cm | Biosense Webster | ||
Midazolam | Actavis | ||
MilliQ | MD Milipore MilliQ Integral Water Purification System | ||
mRuby2 | |||
NaCl 0.9% 500cc | Braun | ||
NOGA guided Myostar injection catheter | Biosense Webster | ||
NOGA-RefStar EFO-patch | Biosense Webster | ||
Pancuronium bromide | |||
Parafilm | VWR | IKAA3801100 | |
PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
PET millicel | Millipore | PIEP12R48 | |
Pirfenidone | Sigma Aldrich | P2116 | Used from 100mM stock in DMSO |
Sodiumthiopental | Inresa | ||
Sufentanil | Sufentanil-Hameln | ||
Tegaderm | |||
UPy-PEG10k | |||
UV-Lamp | |||
Vet ointment | |||
Visipaque contrastfluid 100cc |