फ्लो का प्रयोग कोशिकी vesicles के विश्लेषण के लिए तकनीक
Summary
कई अलग अलग तरीकों फ्लो (FCM) का उपयोग कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) की माप के लिए मौजूद हैं। उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का निर्धारण करते समय कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। मापने ईवीएस के लिए दो प्रोटोकॉल व्यक्ति का पता लगाने या एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर प्रस्तुत कर रहे हैं।
Abstract
कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) सेल सेल संचार में अत्यधिक शामिल कर रहे हैं और जैविक प्रक्रियाओं की एक विविध रेंज को विनियमित करने में मदद कि शारीरिक तरल पदार्थों में पाया छोटे, झिल्ली व्युत्पन्न पुटिकाओं हैं। फ्लो (FCM) का उपयोग कर ईवीएस के विश्लेषण के कारण उनके छोटे आकार और ब्याज की मार्करों के लिए सकारात्मक असतत आबादी की कमी के कारण बेहद मुश्किल हो गया है। काफी पिछले एक दशक से अधिक सुधार हुआ है, जबकि ईवी विश्लेषण के लिए तरीके, अभी भी प्रगति में एक काम कर रहे हैं। दुर्भाग्य से, वहाँ कोई एक आकार फिट सभी प्रोटोकॉल है, और उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का निर्धारण करते समय कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। कई अलग अलग प्रसंस्करण ईवीएस के लिए तकनीक और व्यक्ति का पता लगाने या एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग ईवीएस विश्लेषण करने के लिए दो प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं। एक तर्कसंगत च में आमतौर पर व्यावसायिक तैयारी में पाया एंटीबॉडी समुच्चय को नष्ट करने के साथ सहायता करेंगे यहाँ वर्णित विधियों, बढ़ती संकेत करने वाली शोर अनुपात, और स्थापना के फाटकोंपृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाने कि कम से कम ashion। दूसरा प्रोटोकॉल पर कब्जा करने और छोटे ईवीएस और exosomes पता लगाने के लिए एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जबकि पहले प्रोटोकॉल, नैदानिक नमूने की एक उच्च मात्रा का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग करता है।
Introduction
कोशिकी पुटिकाओं (ईवीएस) सेल सेल संचार में अत्यधिक शामिल कर रहे हैं और जैविक प्रक्रियाओं की एक विविध रेंज को विनियमित करने में मदद कि शारीरिक तरल पदार्थों में पाया छोटे, झिल्ली व्युत्पन्न पुटिकाओं हैं। फ्लो (FCM) का उपयोग कर ईवीएस के विश्लेषण के कारण उनके छोटे आकार और ब्याज की मार्करों के लिए सकारात्मक असतत आबादी की कमी के कारण बेहद मुश्किल हो गया है। काफी पिछले एक दशक से अधिक सुधार हुआ है, जबकि ईवी विश्लेषण के लिए तरीके, अभी भी प्रगति में एक काम कर रहे हैं। दुर्भाग्य से, वहाँ कोई एक आकार फिट सभी प्रोटोकॉल है, और उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का निर्धारण करते समय कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। कई अलग अलग प्रसंस्करण ईवीएस के लिए तकनीक और व्यक्ति का पता लगाने या एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग ईवीएस विश्लेषण करने के लिए दो प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं। एक तर्कसंगत च में आमतौर पर व्यावसायिक तैयारी में पाया एंटीबॉडी समुच्चय को नष्ट करने के साथ सहायता करेंगे यहाँ वर्णित विधियों, बढ़ती संकेत करने वाली शोर अनुपात, और स्थापना के फाटकोंपृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाने कि कम से कम ashion। दूसरा प्रोटोकॉल पर कब्जा करने और छोटे ईवीएस और exosomes पता लगाने के लिए एक मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जबकि पहले प्रोटोकॉल, नैदानिक नमूने की एक उच्च मात्रा का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग करता है।
यह भी microparticles के रूप में जाना जाता ईवीएस, सेल सेल संचार में शामिल हैं और जैविक प्रक्रियाओं एक की एक विविध रेंज को विनियमित करने में मदद कर रहे हैं कि शारीरिक तरल पदार्थों में पाया छोटे, झिल्ली व्युत्पन्न पुटिकाओं हैं। 4 – विभिन्न सतह मार्करों और / या जैविक सामग्री का सीधा हस्तांतरण की अभिव्यक्ति के माध्यम से, ईवीएस को सक्रिय या कहनेवाला संचार 2 में भूमिका को दबा या तो खेलने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के समारोह में परिवर्तन करने में सक्षम हैं। दूसरों ट्यूमर metasta को बढ़ावा देने से, स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए योगदान करने के लिए दिखाया गया है, जबकि चिकित्सकीय, प्लेटलेट व्युत्पन्न ईवीएस, मजबूत थक्का-रोधी गतिविधि 5 है जाना जाता हैरोग सात के खिलाफ की रक्षा करने के लिए बहन 6। ईवीएस उनके आकार और पीढ़ी 8 के तंत्र पर निर्भर करता है, इस तरह के exosomes और microvesicles (MVS) के रूप में सेल व्युत्पन्न vesicles के छोटे श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है। MVS 100 से 1000 बड़े होते हैं, जबकि सेल व्युत्पन्न पुटिका उप-जनसंख्या का नामकरण चल रही बहस 8,9 का विषय बना हुआ है, हालांकि, exosomes आम तौर पर, छोटे रूप में प्लाज्मा झिल्ली के साथ endosomal संलयन से निकाली गई 40 से 100 एनएम कणों वर्णित हैं एनएम कणों प्लाज्मा झिल्ली 10 में बहा द्वारा गठित। इधर, सामान्य शब्द "ईवीएस" कोशिकाओं द्वारा जारी कोशिकी जैविक vesicles के सभी प्रकार का उल्लेख करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
पूरे रक्त से ईवीएस के अलगाव एक बहु कदम प्रक्रिया है और कई अलग अलग प्रसंस्करण चर भंडारण तापमान और अवधि 11,12, थक्कारोधी / परिरक्षक 13 का इस्तेमाल किया और सहित ईवी सामग्री, को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया हैcentrifugation के विधि 14 का इस्तेमाल किया। इन चर के मानकीकरण के लिए एक की जरूरत है घनास्त्रता और Haemostasis वैज्ञानिक और उचित लिए मानकीकरण समिति (ISTH एसएससी) रक्त प्रसंस्करण और ईवी अलगाव प्रक्रियाओं 15,16 पर इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा सिफारिशें करने के लिए नेतृत्व, अभी तक इष्टतम प्रोटोकॉल पर शोधकर्ताओं के बीच कोई आम सहमति वहां मौजूद गया है 12 उपयोग करने के लिए। अधिकांश कसकर नियंत्रित पूर्व विश्लेषणात्मक चर सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा के लिए महत्वपूर्ण हैं, हालांकि, कि सहमत हैं।
ईवीएस का विश्लेषण करने के लिए, शोधकर्ताओं 20,21 और 22,23 सोख्ता पश्चिमी बिखरने संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 17, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 18,19, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी, गतिशील प्रकाश सहित विभिन्न तरीकों का उपयोग किया है। FCM के कई शोधकर्ताओं 9,24 के लिए पसंद की विधि है – इसकी वजह से उच्च throughput क्षमताओं के लिए 26, FCM का उपयोग कर ईवीएस का विश्लेषण किया गया है32 – वजह से उनके आकार और असतत सकारात्मक आबादी 27 की कमी के कारण बेहद मुश्किल। कोशिकाओं के विश्लेषण की तुलना में, जो आवश्यक है कण प्रति एंटीजन की कम संख्या के कारण उत्सर्जित 1) कम प्रतिदीप्ति में ईवीएस परिणामों के छोटे आकार के और बाद के दाग धोने के 2) सीमित व्यवहार्यता, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए। शोधकर्ताओं के बीच आम चुनौतियों इम्युनोग्लोबुलिन समुच्चय 27,28 और एंटीबॉडी 29 के आत्म-एकत्रीकरण से उत्पन्न होने वाले संकेतों में शामिल हैं। इसके अलावा, लंबे समय प्रसंस्करण बार और मौजूदा प्रोटोकॉल 33,34 के कई द्वारा इस्तेमाल किया लंबा धोने / अलगाव प्रक्रियाओं उन्हें उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए आदर्श से कम नहीं है, जिससे नमूने की एक छोटी संख्या का विश्लेषण करने के लिए बहु-दिन के समय प्रतिबद्धताओं की आवश्यकता होती है। कुछ शोधकर्ताओं का सही रूप में बीएसी का आकलन करने के लिए इस तरह के प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) और एंटीबॉडी आइसोटाइप बेकार के रूप में पारंपरिक रूप से इस्तेमाल FCM के नकारात्मक नियंत्रण प्रतिपादन, कुल मिलाकर एक धोने कदम त्यागनाkground प्रतिदीप्ति 30।
एंटीबॉडी समुच्चय और अन्य गैर-पुटिकाओं, अनबाउंड एंटीबॉडी को दूर करने में कठिनाई है, और प्रत्यक्ष सकारात्मक आबादी की कमी से उत्पन्न होने वाले संकेतों: हमारी प्रोटोकॉल ईवीएस के समुचित FCM के विश्लेषण बाधित कर सकते हैं कि तीन आम समस्याओं का समाधान। यहाँ वर्णित तकनीक, सामान्यतः व्यावसायिक तैयारी में पाया एंटीबॉडी समुच्चय को नष्ट करने के संकेत करने वाली शोर अनुपात में वृद्धि, और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाने कि कम से कम एक तर्कसंगत फैशन में फाटकों की स्थापना के साथ मदद करेंगे। दो अलग अलग तरीकों का पता लगाने यहां प्रस्तुत कर रहे हैं: दूसरा प्रोटोकॉल पर कब्जा करने और छोटे ईवीएस और exosomes पता लगाने के लिए एक मोती-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जबकि पहले प्रोटोकॉल, नैदानिक नमूने की एक उच्च मात्रा का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक व्यक्ति का पता लगाने की विधि का उपयोग करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अलगाव, उपचार और ईवीएस के विश्लेषण के लिए दो अलग अलग प्रोटोकॉल एक व्यक्ति का पता लगाने या मनका-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग, प्रस्तुत किए गए। उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त विधि का चयन हमेशा सीधा नहीं है और …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों साधन सेटिंग्स प्रवाह के साथ उनकी मदद के लिए रक्त प्रणाली अनुसंधान संस्थान से डेल Hirschkorn को धन्यवाद देना चाहूंगा। एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया यह काम HL095470 और U01 HL072268 और DoD ठेके W81XWH-10-1-0023 और W81XWH-2-0028 अनुदान।
Materials
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
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