Una guía para la generación y uso de hiPSC NPCs derivados para el Estudio de las Enfermedades Neurológicas

Summary

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Abstract

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Introduction

Estudios de expresión génica de las neuronas diferenciadas in vitro a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) por nosotros ¹ y otros ^2,3 indican que las neuronas hiPSC asemejan fetal en lugar de adultos tejido cerebral. En la actualidad, los modelos basados ​​en hiPSC pueden ser más apropiados para el estudio de la predisposición a, en lugar de características tardía de la enfermedad neurológica. Hemos informado anteriormente de que una fracción significativa de la firma genética de las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia se conserva en las células esquizofrenia hiPSC derivados neurales progenitoras (NPC), indicando que NPC puede ser un tipo de célula útil para estudiar las vías moleculares que contribuyen a la esquizofrenia ¹ . Nosotros y otros han informado de la migración aberrante, aumento del estrés oxidativo y las especies reactivas de oxígeno, la sensibilidad a las tensiones ambientales sub-umbral y la función mitocondrial alterada en la esquizofrenia hiPSC NPC ^1,4-6, así como una disminución c neuronalonectividad y la función sináptica en las neuronas hiPSC esquizofrenia ^5,7-10. Si los factores moleculares que contribuyen a la migración aberrante y / o el estrés oxidativo en la esquizofrenia hiPSC NPCs también subyacen a la conectividad neuronal reducida en las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia, NPC podrían ser una población neuronal robusta y altamente replicativa con el que estudiar los mecanismos responsables de la enfermedad. Además, porque se puede generar rápidamente un gran número de células y no es necesario esperar semanas o meses para la maduración neuronal, ensayos basados ​​en NPC son adecuados para el estudio de grandes cohortes de pacientes y son más susceptibles de cribado de alto rendimiento. Creemos que hiPSC NPCs puede servir como sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad, como ya se ha demostrado en los trastornos tan diversos como la esquizofrenia ¹ y la enfermedad de Huntington ^11.

Para diferenciar los NPCs de hiPSCs, neural inicial enla producción se lleva a cabo por doble SMAD inhibición (0,1 mM y 10 mM LDN193189 SB431542) ^12. Por antagonizar BMP y TGF señalización con estas pequeñas moléculas, endodermo y mesodermo especificación está bloqueada, la aceleración de la diferenciación neuronal y que conduce a la formación de rosetas neuronales visibles dentro de una semana de la siembra. Patrón Neural se produce temprano en este proceso, presumiblemente durante el período de formación de rosetas neural e inmediatamente después. A falta de otros indicios, estas células nerviosas primitivas suponen un-cerebro anterior como el destino anterior ^13. Inmediatamente después de la formación de rosetas neural, y continua a lo largo de la expansión de la APN, NPCs del cerebro anterior se cultivan con FGF2 ^8,14. Tienen potencial linaje dual y se pueden diferenciar de las poblaciones neuronales del 70-80% neuronas III-tubulina-positivas y 20-30% de proteína ácida glial fibrilar (GFAP) -positivos astrocitos (Figura 1). La mayoría de las neuronas del cerebro anterior hiPSC son VGLUT1-positivo, Y también lo son presumiblemente glutamatérgica, aunque aproximadamente el 30% de las neuronas son GAD67-positivo (GABAérgicas) ^8.

NPC se pasan rutinariamente más de diez veces in vitro, mientras que el mantenimiento de los perfiles de diferenciación consistentes, y sin acumular anomalías del cariotipo. Los grupos han reportado NPCs pases más de 40 veces ^15, sin embargo, nos encontramos con que más allá de diez pasajes, NPCs muestran una mayor propensión a la diferenciación de los astrocitos. NPCs bien tolera múltiples congelaciones deshielos y puede ser la transición a crecer como neuroesferas simplemente cultivando en placas no adherentes. NPCs son transducidas eficientemente por vectores virales, lo que permite una rápida evaluación de las consecuencias moleculares y celulares de la perturbación genética, y fácilmente ampliable para producir suficiente material para estudios bioquímicos. Además, porque los vectores virales permiten robusta sobre-expresión y / o desmontables de genes relevantes de la enfermedad, ya sea en el control o paciente derivada neurcélulas de Al, se puede utilizar esta plataforma para probar el efecto de los antecedentes genéticos de estas manipulaciones. Aunque no es adecuado para sináptica o ensayos basados ​​en actividades que requieren las neuronas maduras, NPCs puede ser una alternativa práctica para muchos análisis moleculares o bioquímicos directas de las células neuronales derivadas del paciente.

Protocol

1. hiPSC Diferenciación de células progenitoras neurales Crecer y expandirse hiPSCs en células madre embrionarias humanas (HES) medios de comunicación (Tabla 1) co-cultivadas en un fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) capa alimentadora hasta grandes (pero subconfluentes) colonias están listos para la diferenciación neural a través de un cuerpo embrioide (EB) intermedia (Figura 2). Condiciones de rutina cultura hiPSC están bien descritas en otra parte 16,17;<…

Representative Results

Rosetas neuronales pueden ser identificadas morfológicamente, utilizando un microscopio de campo claro, por su aspecto característico como racimos redondos de células neuroepiteliales con la polaridad-apico basal (Figura 1). Aunque NPCs son típicamente cultivaron a muy alta densidad celular, inmediatamente después de los pases, ligeramente soma de forma piramidal y la estructura de neuritas bipolar es visible (Figura 1D). NPCs validados expresan nestina y Sox2 en la mayoría de las…

Discussion

Hemos descrito los métodos por los que pueda diferenciar hiPSCs en NPCs, un tipo de célula neuronal en la que se conserva una parte importante de la firma genética de neuronas derivadas de hiPSC y que pueden servir como un sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad ^{8, 11.} Además, como hemos detallado, NPCs son una población neuronal robusta replicativa y fácilmente transducidas, que creemos que puede ser adecuado para los estudios moleculares y b…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	for HES media
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	for neural media
KO-Serum Replacement	Life Technologies	#10828	Needs to be lot tested
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
2‐mercaptoethanol (55mM 1000x)	Life Technologies	#21985-023
N2	Life Technologies	#17502-048	Needs to be lot tested
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	Needs to be lot tested
FGF2	Life Technologies	#13256-029	Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189	Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF	Peprotech	#450-10	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP	Sigma	#D0627	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid	Sigma	#A0278	Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104
Collagenase IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminin, Natural Mouse 1mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates	Corning	3506
Ultra low attachment 6-well plates	Corning	3471
goat anti-Sox2	Santa Cruz	sc­17320	use at 1:200
mouse anti-human Nestin	Millipore	MAB5326	use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin	Covance	PRB­435P	use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin	Covance	MMS­435P	use at 1:500
mouse anti-MAP2AB	Sigma	M1406	use at 1:200
Plate centrifuge	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)