神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
我々 1ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）からインビトロで分化したニューロンおよびその他2,3の遺伝子発現研究は、hiPSCニューロンは、胎児ではなく、成人の脳組織に似ていることを示している。現在では、hiPSCベースのモデルではなく後期の特徴、神経疾患より、素因の研究のため、より適切な場合があります。我々は以前のNPCは、統合失調症1に貢献する分子経路を研究するために有用な細胞型であり得ることを示している、統合失調症hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が、統合失調症のhiPSC由来神経前駆細胞（NPCの）に保存されていることを報告している。我々は、他の統合失調症hiPSCのNPC 1,4-6における酸化ストレスおよび活性酸素種、サブスレッショルド環境ストレスに対する感受性およびミトコンドリア機能障害の増加、ならびにニューロンcと減少し、異常な移行が報告されているonnectivityと統合失調症のhiPSCニューロン5,7-10におけるシナプス機能。統合失調症hiPSC NPCの中で異常な移動及び/または酸化ストレスに貢献する分子の要因も統合失調症hiPSC由来の神経細胞における減少し、ニューロンの接続性の根底にある場合は、NPCが疾患の原因のメカニズムを研究するために、堅牢性の高い複製神経細胞集団である可能性があります。一つは、急速に多数の細胞を生成することができるし、ニューロン成熟のために数週間または数ヶ月待つ必要がないので、さらに、NPCベースのアッセイは、より大きな患者コホートの研究に適しており、ハイスループットスクリーニングにより適している。我々はすでに統合失調症1およびハンチントン病11のように多様な疾患において実証されているようにhiPSCのNPCは、潜在的に疾患の病因に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができると信じている。
hiPSCs、の初期の神経からのNPCを区別するために生産は、デュアルSMAD阻害（0.1mMのLDN193189および10mMのSB431542）12によって達成される。これらの小分子とシグナリングBMPおよびTGF拮抗することにより、内胚葉および中胚葉の指定は、神経分化を促進し、めっきの一週間以内に目に見える神経ロゼットの形成をもたらす、遮断される。神経パターニングは、おそらく神経ロゼット形成の期間中とその直後に、早期にこのプロセスで発生します。他の手がかりがない場合には、これらの原始的な神経細胞は、前前脳のような運命13を想定しています。すぐにNPCの拡大を通じて、神経ロゼット形成以下、および継続的な、前脳NPCはFGF2 8,14と培養される。これらは、二重系統可能性を有し、70〜80％のIII-チューブリン陽性ニューロン及び20-30％グリア線維性酸性タンパク質（GFAP） -陽性星状細胞（ 図1）の神経集団に分化させることができる。前脳のhiPSCニューロンの大半はVGLUT1陽性であるニューロンの約30％が、GAD67陽性（GABA作動性）であるが、したがって、おそらくグルタミン酸である8。
NPCは日常的に一貫性の分化プロファイルを維持し、核型異常を蓄積することなく、一方、in vitroで 10回以上継代する。グループが40倍以上15のNPCを継代報告している、しかし、私たちは10継代を超えて、NPCには、アストロサイト分化に増加傾向を示していることがわかります。 NPCは、複数の凍結融雪、よく耐え単に非接着プレートで培養することにより、ニューロスフェアとして成長に移行することができます。 NPCは、効率的に生化学的研究のために十分な材料を得るために急速な遺伝的摂動の分子·細胞影響の評価、および容易に拡張を可能にする、ウイルスベクターによって形質導入されている。ウイルスベクターの過剰発現及び/又は疾患関連遺伝子のノックダウン堅牢許すのでさらに、コントロールまたは患者のいずれかでneur由来らの細胞は、1つは、これらの操作上の遺伝的バックグラウンドの効果を試験するために、このプラットフォームを使用することができる。成熟した神経細胞を必要とするシナプスまたは活動に基づくアッセイに適していないが、NPCは、患者由来の神経細胞の多くの単純な分子または生化学分析のための実用的な代替手段かもしれません。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、NPCのにhiPSCsを区別することによりメソッド、hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が保存された神経細胞の種類を記載しており、それは、潜在的に疾患の病因8に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができる11。私たちは詳細なてきたようにさらに、NPCは確実に複製し、簡単に私たちが病気の素因の分子および生化学的研究のために?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
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