Summary

Investigando mastocitos secretora gránulos; de Biosíntesis de la exocitosis

Published: January 26, 2015
doi:

Summary

El objetivo de este protocolo era desarrollar un método que permita a los análisis de genómica funcional de la secreción de mastocitos. El protocolo se basa en la evaluación cuantitativa de la liberación de un gen indicador fluorescente cotrasfected con el gen de interés y análisis en tiempo real de la morfología de los gránulos de secreción.

Abstract

Los mastocitos (MC) son células secretoras del sistema inmune que logran sus funciones fisiológicas y patológicas mediante la liberación de mediadores alérgicos, inflamatorios e inmunorreguladores preformados y recién sintetizados. Mediadores MCs 'afectan a múltiples tejidos y órganos que culminaron en las respuestas alérgicas e inmunológicas. La síntesis, el almacenamiento y la liberación de los mediadores MC están muy regulados. Los mediadores preformados se embalan en gránulos secretores citoplásmicos (SG) que se fusionan con la membrana plasmática y liberan su contenido por exocitosis regulada. Se presenta un protocolo, basado en la co-expresión de un gen de interés con un gen reportero que se dirige a la SGS y se libera de una manera regulada junto a los mediadores endógenos SG. El protocolo permite una alta resolución de cuatro dimensiones confocal análisis de la MC SGS y el seguimiento de su línea de tiempo de la biogénesis de exocitosis disparado. Por lo tanto, el uso de este protocolo para la detección de genes de interest por su impacto fenotípica y funcional permite descifrar los mecanismos moleculares que gobiernan la biogénesis y exocitosis de la MC SGS y la identificación de los reguladores implicados. Por ello, deben proporcionar más conocimientos sobre los mecanismos celulares que dan cuenta de la función MCs en la salud y la enfermedad.

Introduction

Mastocitos (MC) son células inmunes que son mejor conocidos por su participación en las reacciones alérgicas e inflamatorias tales como la artritis, el asma, la esofagitis eosinofílica, dermatitis crónica y shock anafiláctico 1,2, así como otras patologías como la enfermedad de las arterias coronarias y 3,5 cáncer de 3,4. Además, MCs juegan un papel importante en la inmunidad innata y adaptativa, tanto en la defensa del huésped contra las bacterias y los parásitos y por la supresión de las respuestas inmunes, por ejemplo la inducción de tolerancia aloinjerto 5,6.

MCs se originan en la médula ósea, el desarrollo de CD34 + / CD117 + células progenitoras pluripotentes 7. La médula ósea comprometida progenitores MC se liberan en el torrente sanguíneo y migran hacia los tejidos periféricos de localización predominantemente dentro de los tejidos conectivos y las superficies epiteliales 8. La maduración y la diferenciación terminal se consiguen finalmente bajo la influencia of citoquinas en el 8,9 entorno circundante.

MCs pueden ser activados por un alergeno (antígeno, Ag), cuyo encuentro dado lugar a la generación de inmunoglobulina E (IgE) de tipo anticuerpos. La unión de tales IgE a los receptores Fc RI de la MC, seguido de la reticulación de IgE unido a las células en la re-exposición al mismo Ag, resulta en la agregación de Fc RI y la iniciación de una cascada de señalización que culmina en la desgranulación de células [revisado en 10,11] . MCs también se activan, de forma independiente de IgE, por neuropéptidos 5,12, 13 toxinas, bacterias y antígenos virales 14,15, un número de péptidos cargados positivamente que se hace referencia colectivamente como secretagogos básicas, las células inmunes y citoquinas 5,13,12,16 , 17. MCs también se activan por muchos de sus propios mediadores liberados, que amplifican aún más la respuesta inflamatoria.

MCs están llenas de gránulos de secreción (SGS) que contienen inmunomediadores reguladoras, incluyendo aminas vasoactivas, tales como la histamina y la serotonina (en roedores), proteoglicanos, proteasas, tales como la quimasa y triptasa, factor de crecimiento endotelial vascular y varias citocinas y quimiocinas 8,9. Estos mediadores son "listo para funcionar" y una vez MCs son activados por un estímulo apropiado, estos mediadores se liberan de las células mediante exocitosis regulada (degranulación) en cuestión de segundos a minutos 18,19. Este evento inicial es seguido por la síntesis de novo y la liberación de una gran variedad de sustancias biológicamente potentes, incluyendo metabolitos del ácido araquidónico, múltiples citocinas y quimiocinas 20,21,22. La liberación de productos de nueva síntesis se produce independientemente de la liberación de SG. Colectivamente, estos mediadores inician temprana y de fase tardía respuestas inflamatorias y alérgicas. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de contabilidad para la activación y degranulación MC son tanto de imp teórica y clínicaortance.

La dificultad para manipular genéticamente MCs primarias y cultivadas ha obstaculizado los intentos de dilucidar los mecanismos subyacentes MC degranulación, que quedó mal resueltos. Para superar este problema hemos desarrollado un ensayo basado reportero cotransfectando la línea de mastocitos de la mucosa, rata leucemia basófila (RBL) -2H3 (en adelante denominado como RBL) o derivadas de médula ósea MCs (BMMCs) 30 con un gen de interés y El neuropéptido Y (NPY) fusionado con RFP monomérica (mRFP), como reportero SG.

NPY fue demostrado previamente para recapitular el comportamiento de los marcadores SG endógenos en otros sistemas. Además, debido a mRFP fluorescencia es insensible al pH, la expresión de NPY-mRFP permite la visualización de los SGs ácidas así como la evaluación cuantitativa de la exocitosis mediante el uso de placas de 96 pocillos y un lector de placas de fluorescencia. Hemos demostrado que el NPY-mRFP se entrega a las Comisiones de ácidos de las células RBL y BMMCs y se libera de las célulasde una manera regulada junto con la carga SG endógena (es decir, β-hexosaminidasa y serotonina) 30, 32. Este protocolo proporciona una metodología basada en la proyección de imagen de alta resolución que permite que los genes de detección de interés para su fenotípica y el impacto funcional de las características de la SG y la degranulación de células RBL 32. Específicamente, este protocolo permite el seguimiento en tiempo real de MC SGS y la cuantificación de su área o tamaño del volumen, su número, la cinética de montaje, su movimiento a lo largo del citoesqueleto de la célula y su fusión definitiva con la membrana plasmática en condiciones diferentes. Por ejemplo, la sensibilización de las células con DNP-específico IgE y la activación de las células con un Ag multivalente (DNP conjugado de albúmina de suero) bajo diferentes perturbaciones (es decir, desmontables de genes de interés, sobre la expresión de genes WT o mutantes, o las manipulaciones farmacológicas) y en comparación con las células control.

Protocol

1. Preparación de RBL Cell Culture Media Mezclar 500 ml de medio de Eagle modificado bajo nivel de glucosa de Dulbecco (DMEM) con 56 ml de suero fetal bovino (esto hace que el 10% de FBS), y luego añadir 5,5 ml de penicilina estreptomicina (esto hace ~ 1% de plagas). Filtra los medios de comunicación mediante el uso de 500-1.000 ml Botella-Top Filtros de Vacío con 0,22 m de tamaño de poro y se almacena a 4 ° C. 2. Cultura de células RBL Se cultiva…

Representative Results

Debido a la baja eficiencia de transfección de MCs, las manipulaciones genéticas son poco probable que deje un impacto en las lecturas de la secreción de promedio medidos por los mediadores endógenos SGs. Sin embargo, mediante el establecimiento de completa co-expresión del gen reportero NPY-mRFP y el plásmido co-transfectadas en las mismas células, el seguimiento de los resultados de NPY-mRFP exclusivamente en el seguimiento de la población de células que expresa el gen de interés. Por lo tanto, la ventaja de…

Discussion

Se describe una estrategia innovadora que combina la cuantificación de MCs exocitosis y cuatro (x, y, z, t) cuantificaciones dimensión por imágenes en tres dimensiones de tiempo transcurrido de las Comisiones de Estudio en las células vivas utilizando un gen reportero de exocitosis. Esta técnica permite la detección de las familias de proteínas por su impacto en la función MC como SG de monitoreo a partir tan pronto como su salida del Golgi a través de su maduración, la adquisición de competencias exocitosis …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. U. Ashery por el don de cDNA NPY-mRFP. Agradecemos a los Dres. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani y Y. Zilberstein por su valiosa asistencia con microscopía y análisis de imagen. También agradecemos al Dr. Joseph Orly para la lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de Ciencias de Israel, fundado por la Academia Israelí de Ciencias (1139-1112 a RS-E.).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM Sigma-Aldrich D6046-500ML Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum GE health care Life sciences SH30071.01
Penicillin-Streptomycin Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE) Life technologies R001100 Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3 
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) Sigma-Aldrich G1501
4 mm electroporation cuvettes cell projects EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE Bio rad
Chambered coverglass Thermo scientific 155411
24 well, flat bottom Sigma-Aldrich CLS3524
Corning 96 well plates Sigma-Aldrich CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 Tecan
Calcium ionophore A23187 Sigma-Aldrich C7522 Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) Calbiochem P3766
anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406 
DNP-BSA/ DNP-HAS Sigma-Aldrich A6661 Avoid from direct light exposure
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride MERK 5833
Sodium chloride MERK 6404
Calcium chloride  MERK 2382
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich A4503
Glucose BDH Laboratories 284515V
Monosodium phosphate  MERK 5345
Sterile water

References

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

Play Video

Cite This Article
Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).

View Video