비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에
Summary
본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.
Abstract
마스트 셀 (MC)를 형성 미리 새로 합성, 알레르기 염증 및 면역 매개 물질을 방출하여 생리 학적 및 병리학 적 기능을 수행하는 면역 체계의 분비 세포이다. MC들 '매개 알레르기 및 면역 반응에서 남중 여러 조직과 장기에 영향을 미친다. MC 매개체의 합성, 저장 및 방출은 매우 통제된다. 예비 형성된 매개체는 세포막과 융합 세포 외 유출에 의해 규제 대상 콘텐츠를 해제 세포질 분비 과립 (SG)에서 포장된다. 우리는 SG를 대상으로하고 내인성 SG 매개체와 함께 조절 된 방식으로 방출된다 리포터 유전자를 사용하여 원하는 유전자의 공동 발현에 기초하여 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 MC SG를 분석하고 트리거 세포 외 유출에 생합성에서 자신의 타임 라인을 모니터링 높은 해상도 네 차원 공 초점을 수 있습니다. 따라서, 간 유전자의 스크리닝이 프로토콜을 이용하여자신의 표현형 및 기능에 미치는 영향에 대한 추정치는 MC SG를의 생합성 및 세포 외 유출을 제어하는 분자 메커니즘을 해독과 관련된 규제를 식별 허용한다. 이에 따라, 건강과 질병에서의 MC 기능을 설명 세포 메커니즘으로 더 통찰력이 제공되어야한다.
Introduction
마스트 셀 (MC)은 가장 관절염, 천식, 호산 구성 식도염, 만성 피부염 및 관상 동맥 질환 및 3,5- 포함한 과민성 쇼크 1,2-뿐만 아니라 다른 병리 알레르기 및 염증성 반응에서 이들의 참여를 위해 공지되어있는 면역 세포 암 3,4. 또한, MC라면은 동종 이식 허용 5,6 유도 예를 들어, 박테리아와 기생충에 대한 숙주 방어와 면역 반응의 억제에 의해 모두, 선천성 및 후천성 면역에 중요한 역할을한다.
MC들은 + / CD117 + 능성 전구 세포 (7) CD34에서 개발, 골수에서 유래. 커밋 골수 MC 전구 세포는 혈류에 방출 및 결합 조직과 상피 표면 (8) 내에서 주로 지역화 주변 조직으로 마이그레이션 할 수 있습니다. 성숙 및 터미널 차별화는 결국 영향 O에서 달성주변 환경의 8,9 내에서 F 사이토 카인.
MC라면 누구의 만남 면역 글로불린 E (IgE) 항체 생성의 결과를 입력 알레르겐 (항원),은 (Ag)에 의해 활성화 될 수있다. 동일의 Ag에 다시 노출시 IgE 항체를 결합 셀의 가교 다음에 MC의 FcεRI 수용체, 그러한 IgE 항체의 결합, FcεRI 집계 및 세포 탈과립에 절정 신호 캐스케이드의 개시의 결과는 [10, 11에서 검토] . MC들도, 신경 펩티드 -5,12- 의해 독립적 IgE 항체의 활성 (13), 세균성 및 바이러스 성 항원 14,15 집합 적 분비 기본적인 면역 세포 및 사이토 카인이라고도 5,13,12,16 양전하 펩티드의 수를 독소 17. MC들도 상기 염증 반응을 증폭 자신 방출 매개체 많은 의해 활성화된다.
MC라면은 면역을 포함 분비 과립 (SG를)로 포장된다이러한 카이 메이즈와 트립 타제, 혈관 내피 성장 인자와 여러 사이토 카인과 케모카인 8,9 등의 히스타민과 (설치류) 세로토닌 같은 혈관 활성 아민, 프로테오글리칸, 단백질 분해 효소를 포함하여 규제 매개체. 이러한 매개체는 "갈 준비"하고 MC들이 적절한 자극에 의해 활성화되면, 이러한 매개체는 분 18, 19 초 만에 규제 세포 외 유출 (탈과립)에 의해 세포에서 방출된다. 이러한 초기 이벤트는 아라키돈 산 대사 물질, 여러 사이토 카인 및 케모카인 블랭킷을 포함한 생물학적 효능 물질의 큰 배열의 드 노보 합성 및 방출 이어진다. 새로 합성 된 제품의 출시는 독립적으로 SG 릴리스 발생합니다. 종합적으로, 이러한 매개체는 초기와 후기 단계 염증 및 알레르기 반응을 시작합니다. 따라서, MC 활성화 및 탈과립를 차지 메커니즘을 이해하는 것은 이론 및 임상 꼬마 도깨비의 모두는ortance.
유 전적으로 기본 및 배양의 MC를 조작에 어려움이 제대로 해결 남아 MC 탈과립의 기초가되는 메커니즘을 규명하는 시도를 방해하고있다. 관심의 유전자와 함께이 문제를 극복하기 위해, 우리는 공동 형질 점막 비만 세포주, 래트 호 염기 구성 백혈병 리포터 기재 분석법을 개발 하였다 (RBL) -2H3 (본원 RBL라고 함) 또는 골수 유래의 MC (BMMCs) 30 뉴로 펩타이드 Y (NPY)는 SG의 기자로, 단량체 RFP (MRFP)에 융합.
NPY는 이전에 다른 시스템에서 내생 SG 마커의 동작을 요점을 되풀이 나타났다. MRFP 형광 둔감 pH가 발현하기 때문에 또한 NPY는 MRFP-96- 웰 플레이트 및 형광 플레이트 판독기를 사용하여 산성 SG를 시각화 할뿐만 아니라 세포 외 유출의 정량적 평가를 허용한다. 우리는 NPY-MRFP가 RBL 세포와 BMMCs의 산성 SG를 전달됩니다 보여 주었다과 세포에서 분리 될 때내생 SG화물 (즉, β-소사 미나와 세로토닌) (30, 32)과 함께 규제 방식. 이 프로토콜은 자신의 표현형과 RBL 세포 32 SG 특성과 탈과립에 기능에 미치는 영향에 대한 관심의 선별 유전자를 할 수있는 고해상도 이미지 기반의 방법을 제공합니다. 즉,이 프로토콜은 실시간 MC SG를 추적 및 면적 또는 체적의 크기, 그들의 수, 조립의 동력학, 세포 골격을 따라 자신의 이동 및 다른 조건 하에서 세포막과의 궁극적 인 융합 정량화 할 수있다. 예를 들어, DNP – 특이 IgE 항체와 세포를 민감하고 다른 섭동에서 다가의 Ag (DNP 결합 혈청 알부민)와 세포를 트리거 (즉, 중량 또는 돌연변이 유전자의 발현, 또는 약리학 적 조작을 통해 관심의 유전자의 최저) 및 셀을 제어하는 비교.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 세포 외 유출에 대한 리포터 유전자를 사용하여 살아있는 세포에서의 에스 지에스의 시간 경과 3 차원 화상으로의 MCS 엑소 사이토 시스 및 네 개의 값 (x, y, z, t) 치수 정량화 정량화 결합한 혁신적인 전략을 설명한다. 이 기술은 일찍 성숙을 통해 골지체에서 자신의 출구, 세포 외 유출의 능력과 탈과립를 획득하는 등 시작하는 등 모니터링 SG를 같은 MC 기능에 미치는 영향에 대한 단백질의 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 NPY-MRFP의 cDNA의 선물 박사는 미국 Ashery 감사합니다. 우리는 박사 감사합니다. MJ 코프 론 (Kofron), L. 틀먼, M. Shaharbani 및 현미경에 귀중한 도움을 Y. Zilberstein 및 이미지 분석. 우리는 또한이 원고의 중요한 읽기 박사 조셉 오를리 감사합니다. 이 작품은 과학에 대한 이스라엘 아카데미가 설립 한 이스라엘 과학 재단의 연구비에 의해 지원되었다 (12분의 1,139 RS-E에.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
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