Undersøgelse Mast Cell Sekretorisk Granulat; fra Biosyntese til exocytose
Summary
Målet med denne protokol var at udvikle en metode, der vil gøre det muligt for funktionelle genomiske analyser af mast celle sekretion. Protokollen er baseret på kvantitativ vurdering af udgivelsen af en fluorescerende reporter gen cotrasfected med genet af interesse og tidstro analyser af sekretoriske granula morfologi.
Abstract
Mastceller (MC) er sekretoriske celler i immunsystemet, der udføre deres fysiologiske og patologiske funktioner ved at frigive præformede og nyligt syntetiserede allergiske, inflammatoriske og immunregulerende mediatorer. MC'er 'mediatorer påvirker flere væv og organer kulminerede i allergiske og immunrespons. Syntesen, opbevaring og frigivelse af MC mæglerne er stærkt reguleret. De præformede mediatorer er pakket i cytoplasmatiske sekretoriske granula (SG), der fusionere med plasmamembranen og frigøre deres indhold ved reguleret exocytose. Vi præsenterer en protokol, baseret på co-ekspression af et gen af interesse med et reportergen, der er målrettet til SGS og frigives på en reguleret måde ved siden af de endogene SG mediatorer. Protokollen giver høj opløsning fire dimensional konfokal analyser af MC SGs og overvåge deres tidslinje fra biogenese til udløst exocytose. Således ved hjælp af denne protokol til screening gener af interest for deres fænotypiske og funktionelle konsekvenser tillader decifrere de molekylære mekanismer, der styrer biogenese og exocytose MC SGs og identificere de involverede myndigheder. Derved bør ydes yderligere indsigt i de cellulære mekanismer, der tegner sig for MC'er funktion i sundhed og sygdom.
Introduction
Mastceller (MC) er immunceller, der er bedst kendt for deres deltagelse i allergiske og inflammatoriske reaktioner, såsom gigt, astma, eosinofil esophagitis, kronisk dermatitis og anafylaktisk shock 1,2 samt andre patologier, herunder koronararteriesygdom 3,5 og cancer 3,4. Desuden MCs spiller en vigtig rolle i medfødte og adaptive immunitet, både i vært forsvar mod bakterier og parasitter, og ved undertrykkelse af immunreaktioner, fx inducere allograft tolerance 5,6.
MC'er stammer fra knoglemarven, udvikling fra CD34 + / CD117 + pluripotente stamceller 7. Committed knoglemarv MC progenitorer frigives til blodbanen og migrere ind i de perifere væv lokalisering overvejende inden bindevæv og epiteloverflader 8. Modning og terminal differentiering til sidst opnås under indflydelse of cytokiner inden det omgivende miljø 8,9.
MCs kan aktiveres af et allergen (antigen, Ag), hvis møde resulterede i dannelsen af immunglobulin E (IgE) type antistoffer. Binding af sådanne IgE til MC FceRI receptorer, efterfulgt af krydsbinding af cellebundet IgE ved fornyet behandling med det samme Ag, resulterer i FceRI sammenlægning og indledning af en signaleringskaskade der kulminerer i celle degranulering [revideret i 10,11] . MCs også aktiveres uafhængigt af IgE, som neuropeptider 5,12, toksiner 13, bakterielle og virale antigener 14,15, en række positivt ladede peptider kollektivt benævnt grundlæggende sekretagoger, immunceller og cytokiner 5,13,12,16 , 17. MCs også aktiveres af mange af deres egne frigivne mediatorer, hvilket yderligere forstærker den inflammatoriske respons.
MCs er pakket med sekretoriske granulat (SGS), som indeholder immunoregulatoriske mediatorer, herunder vasoaktive aminer, såsom histamin og serotonin (i gnavere), proteoglycaner, proteaser, såsom chymase og tryptase, vaskulær endotelvækstfaktor og flere cytokiner og chemokiner 8,9. Disse mæglere er "klar til at gå", og når MC'er aktiveres af en passende stimulus, er disse mediatorer frigives fra cellerne ved reguleret exocytose (degranulering) i løbet af få sekunder til minutter 18,19. Denne indledende begivenhed efterfulgt af de novo-syntese og frigivelse af en bred vifte af biologisk potente stoffer, herunder arachidonsyremetabolitter, multiple cytokiner og chemokiner 20,21,22. Frigivelse af nyligt syntetiserede produkter sker uafhængigt af SG udgivelse. Kollektivt, disse mediatorer indlede tidlige og sene fase inflammatoriske og allergiske reaktioner. Derfor forstå de mekanismer, der tegner sig for MC-aktivering og degranulering er både teoretisk og klinisk importance.
Vanskeligheden for genetisk manipulere primære og dyrkede MC'er har hæmmet forsøgene på at belyse mekanismerne bag MC degranulering, som forblev dårligt løst. For at overvinde dette problem, vi udviklede en reporter assay ved co-transfektion af mucosale mastcellelinje, rotte basofile leukæmi (RBL) -2H3 (i det følgende benævnt RBL) eller knoglemarv afledte MC'er (BMMCs) 30 med et gen af interesse og neuropeptid Y (NPY) fusioneret til monomere RFP (mRFP) som SG reporter.
NPY er tidligere vist at rekapitulere adfærd endogene SG markører i andre systemer. Desuden, på grund mRFP fluorescens pH ufølsom ekspression af NPY-mRFP tillader visualisering af de sure strain gauges samt kvantitativ vurdering af exocytose ved anvendelse af 96-brønds plader og en fluorescenspladelæser. Vi har vist, at NPY-mRFP leveres til de sure generalsekretærerne for RBL celler og BMMCs og frigives fra cellernepå en reguleret måde ved siden af endogene SG last (dvs. β-hexosaminidase og serotonin) 30, 32. Denne protokol giver en høj opløsning billeddannelse-baserede metode, der tillader screening gener af interesse for deres fænotypiske og funktionelle indvirkning på SG egenskaber og degranulering i RBL-celler 32. Konkret denne protokol giver real time tracking af MC SGs og kvantificering af deres område eller volumen størrelse, deres antal, kinetik delene, deres bevægelse langs cellens cytoskelet og deres endelige fusion med plasmamembranen under forskellige forhold. For eksempel, sensibiliserende af cellerne med DNP-specifikt IgE og udløser cellerne med en multivalent Ag (DNP konjugeret serum albumin) under forskellige forstyrrelser (dvs. knockdown af gener af interesse, overekspression af vildtype eller mutante gener eller farmakologiske manipulationer) og sammenligning med kontrolceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en innovativ strategi, der kombinerer kvantificering af MCs exocytose og fire (x, y, z, t) dimension kvantificeringer af tidsforkortet tredimensional billeddannelse af SGS i levende celler under anvendelse af et reportergen for exocytose. Denne teknik gør det muligt for screening af familier af proteiner til deres indvirkning på MC-funktion, såsom overvågning generalsekretærerne starter så tidligt som deres exit fra Golgi gennem deres modning, køb af exocytose kompetence og degranulering. Kombination…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. U. Ashery for gaven af NPY-mRFP cDNA. Vi takker Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, og Y. Zilberstein for uvurderlig hjælp med mikroskopi og image-analyser. Vi takker også Dr. Joseph Orly til kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Israel Science Foundation, der blev grundlagt af Israel Akademi for Videnskaber (1139-1112 til RS-E.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
