Summary

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

Published: January 26, 2015
doi:

Summary

Das Ziel des vorliegenden Protokolls war es, eine Methode, die funktionelle Genomanalysen von Mastzellen Sekretion ermöglichen entwickeln wird. Das Protokoll basiert auf einer quantitativen Beurteilung der Freisetzung eines fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem Gen von Interesse und den Echtzeit cotrasfected Analysen der sekretorischen Granula Morphologie.

Abstract

Mastzellen (MC) sind sekretorische Zellen des Immunsystems, die den physiologischen und pathologischen Funktionen durch Lösen vorgeformt und neu synthetisierten allergischen, entzündlichen und immunMediaToren erreichen. MCs "Mediatoren beeinflussen mehrere Gewebe und Organe ihren Höhepunkt in Allergien und Immunreaktionen. Die Synthese, Speicherung und Freisetzung der MC Mediatoren sind stark reguliert. Die vorgeformten Mediatoren in zytoplasmatischen sekretorischen Granula (SG), die mit der Plasmamembran verschmelzen und ihr Inhalt durch regulierte Exozytose verpackt. Wir stellen ein Protokoll, bezogen auf die Co-Expression eines Gens von Interesse mit einem Reportergen, das auf das SGs richtet ist und in einer geregelten Art und Weise entlang der endogenen Mediatoren freigesetzt SG. Das Protokoll ermöglicht hochauflösende vierdimensionalen konfokalen Analysen des MC SGs und Überwachung der Zeitleiste aus Biogenese ausgelöst Exozytose. Somit kann unter Verwendung dieses Protokolls zum Screenen Genen interest für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen ermöglicht die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die Biogenese und Exozytose des MC SGs zu regieren und die Ermittlung der Regulierungsbehörden beteiligt. Dabei sollten weitere Einblicke in die zellulären Mechanismen, die für die MCs Funktion in Gesundheit und Krankheit Konto zur Verfügung gestellt werden.

Introduction

Mastzellen (MC) sind Immunzellen, die am besten für ihre Beteiligung an allergischen und entzündlichen Reaktionen wie Arthritis, Asthma, eosinophile Ösophagitis, chronische Hautentzündung und anaphylaktischer Schock 1,2 sowie andere Erkrankungen, einschließlich koronarer Herzkrankheit 3,5 und bekannt sind, Krebs 3,4. Darüber hinaus spielen MCs eine wichtige Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunität, die beide in der Wirtsabwehr gegen Bakterien und Parasiten und durch Unterdrückung von Immunreaktionen, zum Beispiel induziert Transplantattoleranz 5,6.

MCs stammen aus dem Knochenmark, die Entwicklung von CD34 + / CD117 + pluripotenten Vorläuferzellen 7. Engagierte Knochenmarksvorläuferzellen MC sind in die Blutbahn und wandern in den peripheren Geweben zu lokalisieren überwiegend im Bindegewebe und Epithel-Oberflächen 8. Reifung und terminale Differenzierung werden schließlich unter dem Einfluss o erreichtf Zytokine innerhalb der umgebenden Milieu 8,9.

MCs kann durch ein Allergen (Antigen, Ag), deren Zusammentreffen führte zur Erzeugung von Immunglobulin E (IgE) Antikörper vom Typ aktiviert werden. Die Bindung eines solchen IgE an den MC FcsRI Rezeptoren, gefolgt von Vernetzen des zellgebundenen IgE bei erneutem Kontakt zu derselben Ag, Ergebnis in FcsRI Aggregation und Einleitung einer Signalkaskade, die in Mastzelldegranulation gipfelt [in 10,11 Bewertung] . MCs werden ebenfalls aktiviert, unabhängig von IgE durch Neuropeptide 5,12, Toxine 13, bakterielle und virale Antigene, 14,15, eine Reihe von positiv geladenen Peptide kollektiv als Grund Sekretagoga, Immunzellen und Zytokinen 5,13,12,16 bezeichnet , 17. MCs werden auch von vielen ihrer eigenen freigesetzten Mediatoren, die weiter verstärken die entzündliche Reaktion aktiviert.

MCs mit sekretorischen Granula (DMS), die Immun enthalten verpacktRegelungsmediatoren einschließlich vasoaktive Amine, wie Histamin und Serotonin (bei ​​Nagern), Proteoglykane, Proteasen, wie Chymosin und Tryptase, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und verschiedene Zytokine und Chemokine 8,9. Diese Mediatoren sind "ready to go" und einmal MCs werden durch einen geeigneten Stimulus aktiviert werden diese Mediatoren aus den Zellen durch Exozytose (Degranulation) in einer Angelegenheit von Sekunden bis Minuten 18,19 freigegeben. Diese erste Veranstaltung wird von der De-novo-Synthese und Freisetzung von einer großen Auswahl an biologisch wirksamer Stoffe, einschließlich Arachidonsäure-Metaboliten, mehrere Zytokine und Chemokine 20,21,22 gefolgt. Freisetzung von neu synthetisierten Produkte erfolgt unabhängig von SG-Release. Zusammengenommen sind diese Mediatoren initiieren frühen und späten Phase entzündliche und allergische Reaktionen. Daher Verständnis der Mechanismen Anteil von MC-Aktivierung und Degranulation sind beide von theoretischen und klinischen importance.

Die Schwierigkeit genetisch zu manipulieren primären und kultiviert MCs hat die Versuche, die Mechanismen MC Degranulation zugrunde, die schlecht aufgelöste blieb Aufklärung behindert. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir ein Reporter basierten Assay durch Co-Transfizieren des Schleimhaut-Mastzelllinie, Ratte Basophilenleukämie entwickelt (RBL) -2H3 (hierin als RBL bezeichnet) oder Knochenmark-abgeleitete (MCS BMMCs) 30 mit einem Gen von Interesse und Neuropeptid Y (NPY), fusioniert an monomeren RFP (mRFP) als SG Reporter.

NPY wurde zuvor gezeigt, daß das Verhalten des endogenen SG Marker in anderen Systemen zu rekapitulieren. Da außerdem mRFP Fluoreszenz pH unempfindlich Expression von NPY-mRFP ermöglicht die Visualisierung der sauren SGs sowie quantitative Beurteilung der Exozytose durch Verwendung von 96-Well-Platten und einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät. Wir haben gezeigt, dass NPY-mRFP ist mit den sauren SGs von RBL-Zellen und BMMCs geliefert und wird aus den Zellen freigesetztin einer regulierten Weise neben dem endogenen SG Ladung (dh β-Hexosaminidase und Serotonin) 30, 32. Dieses Protokoll bietet eine hochauflösende Bildgebung basierende Methodik, die Screening Gene von Interesse für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen auf SG Eigenschaften und Degranulation in RBL-Zellen 32 erlaubt. Insbesondere ermöglicht dieses Protokoll in Echtzeit-Verfolgung von MC SGs und Quantifizierung von deren Fläche oder Volumen Größe, ihrer Zahl, Kinetik der Montage, ihre Bewegung entlang der Zelle Zytoskeletts und ihre endgültige Fusion mit der Plasmamembran unter verschiedenen Bedingungen. Beispielsweise Sensibilisierung der Zellen mit DNP-spezifische IgE und Triggerung der Zellen mit einer multivalenten Ag (DNP konjugiert Serumalbumin) unter verschiedenen Störungen (dh Knockdown von Genen von Interesse, über die Expression von wt oder mutierten Genen oder pharmakologischen Manipulationen) und im Vergleich zu Kontrollzellen.

Protocol

1. Vorbereitung der RBL Zellkulturmedien Mischungs 500 ml niedrigen Glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 56 ml fötalem Rinderserum (dies macht 10% FBS), und fügen 5.5 ml Penicillin Streptomycin (dies macht ~ 1% PEST). Filtern Sie die Medien mit 500-1000 ml Bottle-Top Vakuumfilter mit 0,22 um Porengröße und bei 4 ° C. 2. Kultur der RBL-Zellen Wachsen RBL-Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C en…

Representative Results

Wegen der geringen Transfektionseffizienz von MCs sind genetische Manipulationen kaum einen Einfluss auf die Messwerte von durchschnittlich Sekretion von endogenen Mediatoren gemessen SGs verlassen. Dennoch indem vollständige Co-Expression des Reportergens NPY-mRFP und der co-transfizierten Plasmid in die gleichen Zellen, die Überwachung der NPY-mRFP Ergebnisse der Überwachung ausschließlich der Zellpopulation, die das Gen von Interesse exprimiert. Daher ist der Vorteil dieses Assays im Vergleich zu herkömmlichen V…

Discussion

Wir beschreiben eine innovative Strategie, die Quantifizierung von MCs Exozytose und vier (x, y, z, t) Dimension Quantifizierungen kombiniert mit zeitversetzt dreidimensionale Abbildung der SGs in lebenden Zellen mit einem Reportergen zur Exozytose. Diese Technik ermöglicht Screening von Proteinfamilien auf ihre Auswirkungen auf MC-Funktion wie die Überwachung SGs bereits ab ihrem Austritt aus dem Golgi durch ihre Reifung, Erwerb von Exozytose Kompetenz und Degranulation. Die Kombination von Messungen der Exozytose mi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. U. Ashery für das Geschenk des NPY-mRFP cDNA. Wir danken Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani und Y. Zilberstein für wertvolle Unterstützung mit Mikroskopie und Bildanalyse. Wir danken auch Dr. Joseph Orly für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Israel Science Foundation, durch die Israel Akademie der Wissenschaften gegründet, unterstützt (1139-1112 zu RS-E.).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM Sigma-Aldrich D6046-500ML Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum GE health care Life sciences SH30071.01
Penicillin-Streptomycin Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE) Life technologies R001100 Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3 
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) Sigma-Aldrich G1501
4 mm electroporation cuvettes cell projects EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE Bio rad
Chambered coverglass Thermo scientific 155411
24 well, flat bottom Sigma-Aldrich CLS3524
Corning 96 well plates Sigma-Aldrich CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 Tecan
Calcium ionophore A23187 Sigma-Aldrich C7522 Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) Calbiochem P3766
anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406 
DNP-BSA/ DNP-HAS Sigma-Aldrich A6661 Avoid from direct light exposure
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride MERK 5833
Sodium chloride MERK 6404
Calcium chloride  MERK 2382
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich A4503
Glucose BDH Laboratories 284515V
Monosodium phosphate  MERK 5345
Sterile water

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Cite This Article
Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).

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