The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.
Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.
Det enteriska nervsystemet (ENS) är organiserad i två ganglionated plexus inbäddade i väggen i mag-tarmkanalen 1. Dessa intramuskulära nervbanor, myentericus plexus (MP) och submukosala plexus (SMP), består av nervceller och enter glia (Figur 1) 2. MP och SMP reglerar gastrointestinala (GI) funktioner såsom intestinal motilitet och epitelial absorption och utsöndring, respektive 3. Enter glia ligger i omedelbar närhet till nervceller inom ganglierna men populationer av enter glia också finns inom sammankoppling fiber skrifter och extra ganglieblockerande delar av tarmväggen 3,4. Enteriska glia ursprungligen trott att endast närande stöd till nervceller. Men nya studier tyder starkt på att neuron-Glia interaktioner är väsentliga för ENS fungerar 5,6. Till exempel, data visar att enter glia "lyssna" på neuronal aktivitet 7och modulera neuronala kretsar 6,8, skydda enter neuroner från oxidativ stress 9 och kan generera nya enter nervceller som svar på skada 10,11. Protokollet presenteras i denna tekniska översyn ger en enkel och robust metod för att undersöka det komplexa samspelet mellan nervceller och enter glia använder in situ intracellulära Ca2 + avbildning.
Ca2 + är en allestädes närvarande signalmolekyl i exciterbara celler och spelar en viktig roll i synaptiska signaleringshändelser i nervsystemet 12. Excitation av nervceller eller enter glia framkallar en höjd i cytoplasma Ca2 + koncentrationen antingen genom inflöde via Ca2 + -permeable kanaler eller Ca2 + frisättning från intracellulära kalcium butiker. Imaging Ca 2 + transienter i neuroner och glia med fluorescerande färgämnen är en etablerad och allmänt använd teknik för att studera den funktionella organisation och dynamikENS 13-17. Ca 2 + avbildning har visat sig vara ett viktigt verktyg för att studera intakta GI vävnadssegment för att belysa spridningen av retbarhet genom ICC pacemakernätverk 18 och tarm glatt muskulatur 19,20. Det gör det möjligt för forskare att sondera ett brett spektrum av fysiologiska parametrar och ger information om både deras rumsliga fördelning och tids dynamik. Celler kan effektivt färgas i ett minimalt invasivt sätt genom att använda membrangenomträng fluorescerande indikatorer och optimerade färgningsprotokoll 21. Detta ger möjlighet att övervaka ett stort antal nervceller och enter glia i funktionellt bevarade preparat 14-16,22, samt in vivo 23. Hela montering vävnadsberedningar är bulk laddad med en hög affinitet Ca2 + indikatorfärgämne såsom Fluo-4 som ökar dess fluorescens vid bindning till Ca 2 +. Förändringar i fluorescens registreras av en CCD-kamera och analyseras digitalt 6. Tillkomsten av Ca2 + gav möjlighet att övervaka neuron och glia cell interaktioner, lyhördhet för olika stimuli, och medverkan av dessa celltyper i gastrointestinala processer i realtid.
In situ Ca 2 + avbildning har gett stor insikt i signaleringsmekanismer enter neuroner och glia och äger flera distinkta fördelar jämfört cellodlingsmodeller 6,24. Först på plats preparat upprätthålla infödda matrismiljö av nervceller och glia och lämna merparten av sina anslutningar för att rikta vävnad intakt. För det andra är de genetik och morfologin hos odlade enterisk Glia signifikant förändrade jämfört med in vivo-6,24. För det tredje är många heterotypiska interaktioner förlorade i primär cellkultur och detta begränsar utvärdera cell-cell-interaktioner. Även odlade celler är väl lämpade för undersökning av grundläggande egenskaper, deras usefulness för att studera komplexa interaktioner mellan enter glia och nervceller är begränsad. Undersöka neuron-glia samspel med hjälp av en in situ metod är mer fysiologiskt relevant som de synaptiska vägar förblir intakta 25. Jämfört med cellodlingsmetoder, en in situ metod ger bättre förutsättningar för att systematiskt förstå intrikata samspelet mellan nervceller och enter glia. Dessutom är idealisk för fluorescerande avbildning av intracellulära Ca 2 + transienter den plana organisationen av ganglionated plexus i hela monterade förberedelser och denna teknik ger en enkel metod för att bedöma neuron-glia aktivitet i ENS.
The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes.
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure.
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).
Name | Company | Catalog Number |
BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G |
CaCl2 | Sigma | C3306 |
Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 |
Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 |
Dissection tools | Roboz | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI |
Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 |
Glucose | Sigma | G8270 |
Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins |
iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 |
KCl | Sigma | P3911 |
MgCl2 | Sigma | M9272 |
NaCl | Sigma | S9888 |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS |
Nicardipine | Sigma | N7510 |
Perfusion chamber | Custom | |
Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP |
Probenecid | Molecular Probes | P36400 |
Scopolamine | Sigma | S1013 |
Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 |
Sylgard | Dow Corning | 184 |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |