Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
薬剤開発のための現在の単層または懸濁細胞培養アッセイは、ヒト細胞の微小環境をエミュレートし、従って、迅速な脱分化および初代ヒト細胞培養物における機能の喪失につながることに失敗している。より高い生理学的関連性を持つ組織モデルは、臨床試験にそれらを認める前に、化合物の有効性および安全性を予測するために必要とされる。最近、 インビトロ細胞培養技術の標準は、 インビボ組織微小環境を模倣することを目指し、三次元多細胞モデルに向かって二次元単層培養から進化した。これらのシステムは、すでに化合物1,2の作用様式のより正確な予測に向けて大きな改善を示している。さらに、細胞の高度に特殊ニーズにインビトロ培養条件に適応することは特に興味深い。
インビトロ条件下での基準では、重要なCULさまざまそのような栄養と酸素の供給、蓄積物の除去、およびしばしば、ほとんどの場合、十分に制御できない細胞に作用する機械的な力としてトゥーレパラメータ。多くの器官は、物質と溶存酸素の生理学的に関連する濃度勾配を有している。しかし、これらの高度に規制され、最適化された条件は非常に不安定な環境につながると携帯開発3を制限し 、in vitroでの条件の下での組織の周りに制御不可能な拡散勾配に明確な反対している。したがって、より安定し、インビトロ条件下で 、特により定量化は、長期間にわたって生存及び分化細胞を維持するために必要とされる。培地成分は、定期的に除去され、置換されて灌流システムは、多くの場合、組織の直接周囲に係る静置培養よりも良好に特徴付けかつ制御可能である。静的条件、細胞分泌物および培養培地の栄養素の拡散勾配下培養細胞3を囲むことがあります。組織の周りによく特徴付けられた培地流量を導入することは、細胞の分泌物が灌流を通じて豊かな媒体と混合させる。これは、安定した細胞の表現型を確保し、全体の分析時間4を通して酵素発現代謝、定義された細胞の微小環境の生成を可能にする。
多臓器チップ(MOC)における最近の開発は、システムがテスト中に必要な物質の量の減少につながる、マイクロスケールバイオリアクターの小培地と細胞塊の要件に設計された組織の周りの制御媒体流の利点を組み合わせたベース。組織培養のためのいくつかのマイクロ流体システムは、これまでに5,6に記載されている。これらのシステム内の組織対流体の比は、生理学的に関連する細胞のクロストークをシミュレーションする際に特に重要な役割を果たしている。しかし、そのような外部のポンプやメディア貯水池の使用などの技術的な制限、に、目全体的に、ほとんどのシステムでメディア循環量eは、組織体積に比べて大きすぎる。シュラーらのグループは、細胞培養区画内及び生体内の関連組織から流体比7,8 中の物質の適切な滞留時間を確保するシステムを開発した最初の。これはまた、「他の組織」の区画を表す、96ウェルプレートにまで外部リザーバーをスケーリングすることにより達成された。我々のMOCプラットフォーム内の循環媒体ボリュームを最小にするために、我々は、外部メディア回路の必要性を排除する、蠕動オンチップマイクロポンプを集積。このマイクロポンプは、メディアフロー速度とせん断応力速度9の選択可能な数でシステムを動作することができる。 500μmの幅と100μmの高さのマイクロ流体チャネルシステムは、各96ウェルプレートの1ウェルのサイズを有する、2つの標準化された組織培養空間を相互接続する。業界標準のウェルプレートのサイズに付着するSは、トランスウェル形式で作成、既存の組織モデルの統合を可能にする。さらに、トランスウェル細胞培養インサートの垂直位置は、直接流体の流れにさらされない組織モデルの栽培を可能にする、調整可能であるが、持ち上げられ、基礎となる電流から遮蔽することができる。同様に、気液界面培養物は、このシステムを用いて実現可能である。
MOCプラットフォームは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)層2ミリメートル高い恒久的に流体密なマイクロ流体回路を形成するために、低圧プラズマ酸化により接合されている75×25 mm 2以上のフットプリントを有するガラス顕微鏡スライドから製造される。各チャネルおよび細胞培養区画を含むPDMS層は、標準的なソフトリソグラフィーとレプリカ成形9により製造される。この試験中に使用されるMOCのマイクロ流体設計では、それぞれ2つのセルcを保持し、チップ当たり2つの別々のマイクロ流体回路から構成され100μmの高いチャネルシステムによって相互接続ultureコンパートメント。これは、1つの多臓器チップを使用して、2つの個別の二組織の同時培養の性能を可能にした。ポンピング周波数/分の40μlの培地流量を得るために調整した。
この二組織MOC設計は生理的流れの条件下で、複合メディア回路ではあるが、別個の培養空間に肝スフェロイド及び皮膚パンチ生検を共培養する能力を提供した。均一なスフェロイドを形成するために1:分化したHepaRG細胞を24の割合で、ヒト肝星細胞(HHSteC)と共に凝集させた。この比は、肝細胞のほぼ倍の数は、インビボでの状況と比較して使用しても、でも、先の実験10で観察されたように、最適であることが見出された。皮膚は、このように局所物質の曝露を可能にする、トランスウェル細胞培養インサート内の空気 – 液体界面で培養した。これらの組織モデルは、28日間共培養されたこのシステムの包括性を実証するMOCでAYS。さらに、チップのマイクロ流体チャネル回路は、完全に、より密接に血管系をシミュレートするために、ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HDMEC)で覆った。
ここで説明MOCプラットフォームは長期培養期間10,16上に動的な媒体流条件で、様々な起源の組織を培養するための安定した強力なツールを表します。この例では、プラットフォームは、一次細胞(HDMEC)、細胞株から生成された組織等価物(肝臓凝集体)、及び組織生検と前述の共培養を培養するために使用した。 MOCは、結合された媒質回路内に最大28日間、3組織の共培養を維持することができました。著者の知る限り、これは生検、初代細胞および細胞株を含むマルチ組織の共培養は、4週間に渡って行われたのは初めてです。
マイクロ流体システムの主要な欠点の1つは、流体回路の表面材料に付着する小分子の親和性である。体積比表面がマイクロ流体システムにおいて特に高いため、この効果は17より顕著になる</s>アップ。ここで紹介するチャネルの安定HDMECカバレッジは、MOCへの分子の付着を防止する生物学的障壁として作用するかもしれない。また、血液凝固を防止する、全血の循環のための血液適合性容器として機能することができる。臓器等価物の完全な血管新生は、まだ達成されていないただし、媒体置換として全血を使用することは不可能である。 インビトロと生成さ組織の血管新生に既存の作業は有望であると、さらなる研究18,19への道を案内する。
これは、肝細胞がインビトロ静的二次元培養条件の下で20時間にわたってそれらの肝臓特異的機能を失う傾向にあることがよく知られている。ある種の薬物の代謝を研究する場合にはそのようなチトクロームP450ファミリーの酵素を、代謝、特別な重要である。シトクロムP450 3A4、多くの生体異物の生体内変換に関係する酵素、およびシトクロムP450 7Aは、ワットHICHは、胆汁酸合成に関与する、14日間にわたってMOC培養集約肝臓で発現させた。これは、薬物代謝研究を考慮して、代謝的に活性な表現型の維持を示している。静的培養物と比較してMOCにおける凝集体の増加したアルブミン産生率は、適切な培養条件のために、追加の指標である。 23しかし、値は一次ヒト肝細胞培養物24のものに到達しなかった–この試験中に観察されたアルブミン産生率は21 HepG2細胞を含む流体チップにより得られた以前に報告された値に匹敵するまたはそれ以上であった。さらに、MOCシステムは、その一時的なレイアウトで、胆汁の別々の分離を可能にしない。 MRP-2染色によって示されるように、集約偏と形成された毛細胆管様構造中の細胞。しかし、これらの細管は、胆汁を集める技術的なチャネルに接続されていなかった。この非生理ミックス血液区画と胆汁のると、システムの将来の再設計で対処する必要がある。
流量特性の調整は、特に肝臓のような剪断応力に敏感な組織に関連して、重要度の高い25である。組織によって知覚されるせん断応力の量は、2つの方法で変更することができる:第一に、ポンプの膜を押し下げるために使用される空気の圧力は、システム内のピークせん断応力値を低下させる、低下させることができる。第二に、組織は、細胞外マトリックスに埋め込まれたレイヤリングまたはトランスウェル培養インサートで培養することができる。後者は、多孔質膜と、基礎となる電流から組織を保護する。これらの調整は、MOC、実験を開始する前に、各臓器に相当するため、個別に実行する必要がある。 144ビートの高い、まだ生理学的、心臓の活動に対応し、例えば2.4ヘルツの拍動動作、時/分、ヒトにおいて、剪断応力がで測定微小回路のチャンネルは、約25ダイン/ cm 2に達する 。これは微小血管系におけるスケールの上限で生理的剪断応力に相当し、従って、チャネルの内皮化を含む実験のために十分に適用可能である。提示MOCシステムの現在のマイクロ流体のレイアウト二臓器コンパートメントを接続する唯一のメディア回路で構成されてしかし、一つのポンピング速度と剪断応力速度は、システム全体のために選択されなければならない。したがって、それぞれの単一の器官のニーズに流動特性の正確な調整が必ずしも実現可能ではない。
さらに、注意は、一般的な培地に細胞を調節する際に注意しなければならない。細胞は、 インビトロ細胞培養のための標準であるので、従って、全く個別の細胞培養培地は、それぞれの組織モデルのために使用することができない、複合メディア回路にMOCで培養される。最小限の複合培地処方は、予めとtを定義する必要彼細胞は、この新しいメディアに段階的に調整する必要がある。 2日間の新しいメディアの古い80%/ 20%の調整手順は、次に50%/ 50%、20%/ 80%、続いて、完全な交換は常に我々の手での培養物の合理的な細胞生存率および機能性をもたらした。
MOCシステムの現在のマイクロ流体レイアウトは、最大3つの組織の共培養することができます。人体の少なくとも10個の最も重要な器官の共培養は、恒常性を達成するために必要とされる。したがって、提示システムは、特定の組織 – 組織相互作用ではなく、物質の真の全身性の応答を予測することができる。以上の臓器キャビティを含むようにMOCのさらなる開発が想定される。さらに、システムの有効性は、参照化合物のセットを用いて示されるべきである。好ましくは、(例えば、トログリタゾンなど)、臨床試験中に失敗した化合物は、MOCにおけるそれらの性能について試験される。そのような複雑なシステムの真の検証はまだBが阻害され、一方でYこのと同様のシステムの毒性学的パフォーマンスに多くのデータを収集する機能評価のためのバイオマーカーおよびエンドポイントに関する標準化の欠如は、彼らの信頼性と適用領域を広げるます。
The authors have nothing to disclose.
仕事はGO-バイオ認可番号0315569、教育研究のために、ドイツ連邦省によって資金を供給されています。
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |