Протокол Lentiviral трансдукции и вниз по течению анализа заболеваемости кишечными органоиды
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
Кишечного эпителия является одним из самых быстро размножающихся тканях организма, что вызвало это, чтобы привлечь широкий интерес со изучению рака и стволовых клеток. В 2009 методика была опубликована генерировать длительные культуры малочисленных кишечных крипт в матригеле, сохраняя в 3 трехмерную структуру 1. Эти структуры, называемые кишечные органоиды, можно культивировать с использованием стандартных методик, с окружающей средой с добавлением нескольких определенных факторов роста, в том числе БМП-сигнализации ингибитора пути Noggin (Nog), Wnt-сигнального пути энхансер rspondin 1 (RSPO1) и эпидермальный фактор роста (EGF) всех найденных в целях повышения кишечной пролиферации 2-4.
Органоиды превзойти традиционные линии раковых клеток в тех аспектах, что они немутированный, сохранили иерархию стволовых клеток, отображения нетронутыми сотовой поляризацию и выставочная дифференциации во всех линиях клеток, находящихся в зарождающейся небольшой Intestinal эпителий. Так как они могут быть трансдуцированных осуществлять трансгенов или РНК-интерференции создает 5, они используются для изучения специфических генетических элементов, перевешивает эксперименты с использованием трансгенных мышей, в аспектах стоимости и скорости. Трансгенные выражение органоидам может быть выполнена с использованием либо мышиный ретровирусную или лентивирусов векторов 6,7. Из-за ограничений мышиных ретровирусов, способных к трансдукции митотических клеток исключительно 8, лентивирусов трансдукции чаще используется для клеток, которые трудно заразить, например, органоидам.
Виралли трансдуцированных и стабильно экспрессирующие трансгенные органоиды может быть использован для множества последующих анализов, в том числе количественный анализ РНК и иммуногистохимии. Взятые вместе, культура органоидов из первичных клеток эпителия кишечника превратилась в обычного метода, который легко реализовать без особых лабораторных требований, и стал роман стандарт CELL культура в исследованиях по кишечного эпителия.
Методы вирусного преобразования и последующей вниз по течению анализа в органоидов утомительны для выполнения и оказания помощи Органоид эксперименты мы получили это видео Протокола, с указанием методов лентивирусным трансдукции в культуре органоидов. Мы дополнительно показать, как корректная обработка органоидов может увеличить урожайность и, следовательно, повысить производительность ниже по течению анализа с использованием методов РНК или иммуногистохимии. В протоколе, органоиды, которые получены из небольших кишечных крипт были исключительно используются, хотя способы, описанные, могут быть применены к ободочной органоидам а.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол ток ролик описывает Lentiviral трансдукции органоидов из первичного кишечного эпителия и вниз по течению анализа этих органоидов, используя количественные методы РНК и иммуногистохимии.
Lentiviral трансдукция часто выполняется в прикрепленных или плавающих клеток в к…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).
- Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).
