Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
El epitelio intestinal es uno de los tejidos corporales que proliferan más rápidamente, lo que ha causado a atraer amplio interés de la investigación sobre células cancerosas y madre. En 2009 se publicó una técnica para generar culturas de larga duración de las pequeñas criptas intestinales en matrigel, conservando una estructura dimensional 3 1. Estas estructuras, denominadas organoides intestinales, pueden ser cultivadas utilizando técnicas estándar, y la zona medio suplementado con un número de factores de crecimiento definidos, incluyendo la BMP-noggin inhibidor de la vía de señalización (Nog), el potenciador de la vía Wnt de señalización rspondin 1 (Rspo1) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) encuentran todos para mejorar la proliferación intestinal 2-4.
Organoides superan las líneas tradicionales de células de cáncer en los aspectos que son no mutado, han mantenido jerarquía de células madre, muestran la polarización celular intacta y la diferenciación de exposiciones en todos los linajes de células que se encuentran en la naciente pequeña intepitelio estinal. Puesto que pueden ser transducidas para llevar a transgenes o la interferencia de ARN construye 5, que se utilizan para estudiar elementos genéticos específicos, que prevalezca experimentos usando ratones transgénicos en facetas de costo y la velocidad. La expresión transgénica en organoides se puede realizar utilizando cualquiera retroviral murino o vectores lentivirales 6,7. Debido a las limitaciones de los retrovirus murinos, capaces de transducir células mitóticas exclusivamente 8, la transducción lentiviral se utiliza con más frecuencia para las células que son difíciles de infectar, tales como organoides.
Virally transducidas y que expresan establemente organoides transgénicos pueden ser utilizados para una multitud de análisis aguas abajo, incluyendo ARN análisis cuantitativos e inmunohistoquímica. En conjunto, la cultura de organoides de células epiteliales intestinales primarias se ha convertido en una técnica rutinaria que es fácil de implementar, sin requisitos específicos de laboratorio, y se ha convertido en la novela de serie en cecultura ll en la investigación sobre el epitelio intestinal.
Técnicas de transducción viral y análisis de aguas abajo posterior en organoides son tediosos para realizar y ayudar experimentos organoides generamos este protocolo de vídeo, que muestra los métodos para la transducción lentiviral de organoides cultivadas. Tenemos, además, muestra cómo el procesamiento correcto de organoides puede aumentar el rendimiento y, por tanto, mejorar el rendimiento de análisis de aguas abajo usando técnicas de ARN o inmunohistoquímica. En el protocolo, se utilizaron exclusivamente organoides que se derivan de pequeñas criptas intestinales, aunque las técnicas descritas pueden aplicarse a organoides colon también.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de vídeo actual describe la transducción lentiviral de organoides de epitelio intestinal primaria y análisis de aguas abajo de estos organoides utilizando técnicas de ARN cuantitativos e inmunohistoquímica.
Transducción lentiviral se realiza a menudo en las células adherentes o flotantes en placas de cultivo. Dado que la estructura tridimensional de organoides los hace difíciles de penetrar por las partículas virales, se utiliza un número de métodos para aumentar la e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
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