Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
O epitélio intestinal é um dos tecidos corporais mais proliferam rapidamente, o que fez com que ele atrair grande interesse da pesquisa sobre as células cancerosas e tronco. Em 2009, uma técnica foi publicado para gerar culturas de longa duração de pequenas criptas intestinais em matrigel, conservando uma estrutura dimensional 3 1. Estas estruturas, denominado Organóides intestinal, pode ser cultivado usando técnicas convencionais, com áreas meio suplementado com um número de factores de crescimento definidas, incluindo a BMP-inibidor da via de sinalização noggin (nog), o intensificador de via de sinalização Wnt-1 rspondin (RSPO1) e factor de crescimento epidérmico (EGF) todos encontrados para aumentar a proliferação intestinal 2-4.
Organóides superar tradicionais linhas celulares de cancro nos aspectos que são não mutado, mantiveram hierarquia de células-tronco, exibir polarização celular intacto e diferenciação exposição em todas as linhagens de células encontradas na nascente pequeno intepitélio estinal. Uma vez que podem ser transduzidas para transportar transgenes ou interferência de ARN constrói 5, eles são utilizados para estudar os elementos genéticos específicos, compensando experiências utilizando ratinhos transgénicos em facetas de custo e de velocidade. A expressão transgénica em Organóides pode ser realizada utilizando retrovírus murino ou vectores lentivirais 6,7. Devido às limitações de retrovírus murino, capazes de transdução de células mitóticas exclusivamente 8, transdução lentiviral é mais frequentemente usado para células que são difíceis de infectar, como Organóides.
Viralmente e transduzidas que expressam estavelmente Organóides transgénicas podem ser usadas para uma multiplicidade de análises a jusante, incluindo ARN análises quantitativa e imuno-histoquímica. Tomados em conjunto, a cultura de Organóides de células epiteliais do intestino primárias evoluiu para uma técnica de rotina que é fácil de implementar, sem requisitos laboratoriais específicos, e tornou-se o novo padrão em cecultura ll em pesquisas sobre o epitélio intestinal.
Técnicas de transdução viral e análise jusante subsequente em Organóides são entediantes para executar e para ajudar experimentos organóide geramos este protocolo de vídeo, mostrando métodos para a transdução de lentivírus de Organóides cultivadas. Nós, adicionalmente, mostrar como correto processamento de Organóides pode aumentar o rendimento e, portanto, melhorar o desempenho da análise a jusante, utilizando técnicas de RNA ou imuno-histoquímica. No protocolo, Organóides que são derivados a partir de pequenas criptas intestinais foram utilizados exclusivamente, embora as técnicas descritas podem ser aplicadas a Organóides do cólon, bem.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo de vídeo actual descreve transdução lentiviral de Organóides de epitélio intestinal primária e análise a jusante destas Organóides RNA utilizando técnicas quantitativas e imuno-histoquímica.
Transdução de lentivírus é freqüentemente realizada em células aderentes ou flutuantes em placas de cultura. Uma vez que a estrutura tridimensional de Organóides torna difícil de penetrar por partículas virais, um número de métodos para aumentar a eficácia são utilizado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
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