Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System
Summary
Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.
Abstract
Gene Targeting ist ein kritischer Ansatz zur Charakterisierung von Genfunktionen in der modernen biomedizinischen Forschung. Allerdings ist die Effizienz des Gen-Targeting in menschlichen Zellen ist gering, was die Herstellung von humanen Zelllinien mit einer gewünschten Geschwindigkeit verhindert. Die letzten zwei Jahre haben eine schnelle Progression auf die Verbesserung der Effizienz der genetischen Manipulation von Genom-Editing-Tools wie dem CRISPR (Clustered regelmäßig beabstandet Short Palindromic Repeats) / CAS (CRISPR-assoziierten) System erlebt. Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von linienspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Reportern mit CRISPR / Cas-System unterstützt die homologe Rekombination. Verfahren für den Erhalt notwendigen Komponenten für die Herstellung von neuralen Abstammung Reporter Linien mit dem CRISPR / Cas-System, die sich auf Bau von Targeting-Vektoren und einzelne Führungs RNAs, werden beschrieben. Dieses Protokoll kann zu Plattform Einrichtung und Mutation Korrektur in hiPSCs verlängert werden.
Introduction
CRISPR (Clustered regelmäßig beabstandet Short Palindromic Repeats) / CAS (CRISPR-assoziierten) System, zusammen mit anderen Genom-Editing-Tools, hat das menschliche Genom Manipulation in den letzten Jahren 1-7 revolutioniert. Hauptkomponenten in der CRISPR / Cas9 System sind einzelne Führungs RNA (sgRNA) und Cas9. Cas9 ist ein RNA-geführten Typ-II-DNA-Endonuklease. Es hat zwei Nuklease Domänen HNH und RuvC, die neben einer protospacer benachbarten Motiv für die Herstellung von DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) zu einem bestimmten genomischen Region verantwortlich sind (PAM) 7-10 .Ein sgRNA hat eine kombinierte Funktion derjenigen crRNA und tracrRNA, zwei adaptive in Bakterien (wie Streptococcus pyogenes) und Archaeen identifiziert Immunität RNA-Moleküle, gegen DNA Invasion von exogenen Quellen 9-11 kämpfen. Bei entsprechend gestalteten und auf Säugerzellen co-eingeführt erkennt der sgRNA die PAM-Sequenz, Basenpaare mit dem komplementären Strang der Ziel-DNA, und Führungen und transaktiviert Cas9 abzuspaltenan beiden DNA-Stränge unmittelbar stromauf von PAM 7. Anschließend homologen Rekombination (HDR, in Gegenwart eines Targeting-Vektors) oder nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) auftreten wird, um die Doppelstrangbrüche zu reparieren. Transgene, wie beispielsweise cDNAs, Reporterkassetten oder Antibiotika-resistente Fragmente können integriert werden, und transgene oder knockin Linien.
Obwohl die CRISPR / Cas9 System ist sehr effizient und relativ spezifisch, unerwünschte Off-Target Aktivitäten wurden berichtet 12-15. Um Off-Target-Ereignisse zu minimieren, haben Cas9 nickases (Cas9n) auch ausgeführt worden, 9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A oder Cas9 H840A) ist Cas9 Enzym mit Mutationen in einem der zwei Nuklease Domänen, die nur löst eine nick an einem DNA-Strang. Zur Spaltung an beiden Strängen zu erzielen, werden zwei sgRNAs gestaltet, um ein Paar nickases, die separat an den nahe gelegenen Orte der zwei verschiedenen DNA-Stränge schneidet führen. Die "Doppel Nicking" Strategie erfordert eine more strengen Design als die herkömmliche Cas9 Plattform und bietet sowohl eine hohe Effizienz und eine hohe Spezifität für die Gen-Bearbeitungs Experimenten.
Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von linienspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Reporter mit CRISPR / Cas-System unterstützt die homologe Rekombination. Schritte zur Erlangung der erforderlichen Komponenten für die Herstellung von neuralen Abstammung Reporter Linien mit dem CRISPR / System vermittelt Cas Genom Bearbeitung beschrieben, mit einem Fokus auf Bau von Targeting-Vektoren und sgRNAs. Dieses Protokoll wurde erfolgreich in mehreren hiPSC Leitungen einschließlich von gesunden Personen und von Patienten mit Erkrankungen des ZNS abgeleitet wiederholt. Gene, die in unserem Labor gezielt gehören OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 und SOD1. Targeting-Effizienz von CRISPR / Cas System vermittelte homologe Rekombination in hiPSCs im Bereich von 20-40%, was mit früheren Berichten 1,18,19 ist. Im Vergleich zu einem typical Effizienz von 1-2% in konventionellen Gen-Targeting-Experimente wird das Targeting-Effizienz deutlich verbessert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gene targeting is an essential tool in characterizing gene functions. However, the relatively low efficiency demands labor-intensive and time-consuming work. Recently development on genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system has greatly improved the targeting efficiency. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Steps …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Department of Neurosurgery, Memorial Hermann Foundation Staman Ogilvie Fund, the Bentsen Stroke Center at the University of Texas Health Science Center at Houston, and Mission Connect TIRR Foundation.
Materials
| Name of Material/Equipment | Vendor | Catalog no. |
| pStart-K | Addgene | 20346 |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 |
| pKD3 | Addgene | 45604 |
| pKD46 | The Coli Genetic Stock Center, CGSC | 7634 |
| PGK-neo-bpA sequence | Addgene | 13442 |
| Human BAC clones of target genes | https://bacpac.chori.org | |
| JDS246 (Cas9-003), Mammalian codon-optimized streptococcus pyogenes Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 |
| MLM3636, Human-gRNA-ExpressionVector with U6 promoter | Addgene | 43860 |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 |
| sgRNA design, ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | |
| Off target prediction tool CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | |
| Perl | http://www.perl.org/get.html | |
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | |
| sgRNA Primer synthesis | Sigma | |
| One shot Top10 Electrocomp E. Coli Competent cells | Life Technologies | C4040-50 |
| AccuPrime Pfx SupperMix | Life Technologies | 12344-040 |
| Restriction enzymes | NEB and Life Technologies | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Researech | D4007 |
| DNA quick extraction buffer | Epicentre | QE0905T |
| Herculase II Fusion DNA Polymerases | Agilent Technologies | 600675 |
| Digestion buffer 2 | New England Biolab | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 |
| TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance | Stem Cell Technologies | 05940 |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 |
| 50xTAE | Life Technologies | B49 |
| Essential 8 medium | Life Technologies | A1517001 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Life Technologies | A12856-01 |
| D-MEM/F12 with Glutamax | Life Technologies | 10565018 |
| D-MEM with Glutamax | Life Technologies | 10566040 |
| Fetal Bovine Serum-ES cell qualified | Life Technologies | 10439 |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828010 |
| 2-mercaptoethanol 1000X | Life Technologies | 21985023 |
| Non Essential Amino Acid | Life Technologies | 11140050 |
| Stempro Accutase | Life Technologies | A1110501 |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 |
| 0.25% Trypsin- EDTA solution | Life Technologies | 25200-056 |
| Geltrex | Life Technologies | 12760-013 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Millipore | SCM075 |
| SMC4 reagent | BD | 354357 |
| Neomycin resistant MEF | Millipore | PMEF-NL |
| Hygromycin resistant MEF | Millipore | PMEF-HL |
| G418 (Geneticin) | LifeTechnologies | 11811 |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687010 |
| FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil | Moravek Biochemicals and Radiochemicals | M251 |
| Electroporator: Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2088 |
| DIG-High prime DNA labeling and detection starter kit II | Roche | 11585614910 |
| Hybridization denature solution | VWR | 82021-478 |
| PCR DIG probe synthesis kit | Roche | 11636090910 |
| DIG wash set | Roche | 11585762001 |
| Anti-Digoxigenin (DIG-AP) | Roche | 11093274910 |
| CSPD chemiluminescence system | Roche | 11755633001 |
| DIG wash and block buffer set | Roche | 11585762001 |
| 50X TAE buffer | Life Technologies | 24710030 |
| Blotting buffer (25 mM Tris pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween20) | ||
| Hoefer Ultraviolet Crosslinker | Fisher Scientific | 03-500-308 |
| Spermidine | Fisher | AC13274-0010 |
| Tris HCl 2M ( pH 7.5 ) | VWR | 200064-506 |
| Denville Scientific blue bio film 8×10 | Fisher | nc9550782 |
| DNA molecular weight marker II ( DIG-labeled ) | Roche | 11218590910 |
| Amersham Blotting membrane Hybond-N+ | Roche | 95038-400 |
| Pyrex glass drying tray | Fisher | 15-242A |
| Kimberly-Clark C-fold paper towels | Fisher | 06-666-32B |
| Whatman 3MM paper ( 26X41) | Fisher | 05-713-336 |
| Hybridization bag | Roche | 11666649001 |
| Hybridization tubes | Fisher | 13-247-300 |
| Hybridization oven rotisserie Shake 'n' Stack | Fisher | HBMSOV14110 |
References
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