Dit artikel beschrijft de techniek die wordt gebruikt om dubbelkanaals optisch karteren uit te voeren in gekweekte HL-1 atriale celmonolagen. Dit unieke protocol maakt de gelijktijdige visualisatie van zowel calcium (Ca) als spanning (Vm) activiteit in hetzelfde gebied mogelijk voor de gedetailleerde detectie en analyse van elektrofysiologische eigenschappen van gekweekte monolagen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Optische mapping heeft bewezen een waardevolle techniek cardiale elektrische activiteit te detecteren op zowel intacte ex vivo hart en in gekweekte myocyten monolagen zijn. HL-1-cellen zijn op grote schaal gebruikt als een 2-dimensionale cellulaire model voor het bestuderen van verschillende aspecten van cardiale fysiologie. Echter, is het een grote uitdaging om optisch kaart calcium (Ca) transiënten en actiepotentialen tegelijkertijd uit hetzelfde gezichtsveld in een beschaafde HL-1 atriale celmonolaag. Dit is omdat speciale behandeling en zorg nodig gezonde cellen die elektrisch kunnen worden vastgelegd en optisch gekoppeld bereiden. Daarom hebben wij een optimale werking protocol voor dual channel optische mapping ontwikkeld. In dit manuscript, hebben we in detail beschreven hoe de dual channel optische mapping experiment uit te voeren. Dit protocol is een nuttig instrument om het begrip van de actiepotentiaal vermeerdering en Ca kinetiek in aritmie ontwikkeling te vergroten.
Inleiding
Een uniek calcium (Ca) en spanning (V m) dual channel optische mapping techniek 1-5 is in opkomst als een efficiënt instrument om tegelijkertijd op te nemen V m en Ca-signalen in zowel intacte hart en gekweekte celmonolagen. Deze techniek maakt het mogelijk om krachtige informatie over de relatie tussen calcium transiënten en actiepotentialen beter inzicht in de onderliggende elektrofysiologische mechanismen van cardiale aritmieën verkrijgen.
Gekweekte cel monolagen heeft bewezen een geschikte cellulaire model cardiale elektrofysiologie en het onderliggende mechanisme van aritmieën bestuderen. 4,6-8
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Oplossing Voorbereiding
- Noradrenaline (NP) oplossing
- Los op 40 mg NP in 25 ml 30 mM ascorbinezuur (0,1475 g ascorbinezuur in 25 ml gezuiverd Milli-Q (MQ) water. Vermijd directe blootstelling aan licht tijdens deze oplossing voorbereiding omdat norepinefrine (NP) is lichtgevoelig.
- Filter de NP-oplossing met een 0,22 pm spuitfilter. Aliquot de oplossing in 1 ml steriele microbuisjes en bewaar bij -20 ° C. Eenmaal bevroren, NP is een maand stabiel.
- Aangevulde Wash en Final Claycomb media
- Begin met 43,5 ml Claycomb medium en aangevuld met 5 ml foetaal runderserum (FBS), 0,5 ml penicilline / streptomycine, 0,5 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een beschaafde samenvloeiende monolaag vertoont een regelmatige intrinsieke ritme zoals aangetoond in Film 1. We vervolgens uitgevoerd V m / Ca dual channel optische mapping in een volledig samenvloeiende HL-1 monolaag. Figuur 1A toont bijvoorbeeld sporen van V m en Ca-signalen van een opgenomen enkele verslaan. Representatieve isochrone kaarten gelijkmatig gekweekte Vm en Ca signalen via de tweekanaals optische mapping systeem getoond in figuren.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft de belangrijkste aspecten van de optische kaart brengen in een beschaafde HL-1 atriale myocyt monolaag gekleurd met calcium en spanning gevoelige fluorescerende kleurstoffen. Het omvat het kweken van een optimale HL-1 celmonolaag, setup van het in kaart brengen van apparatuur, in kaart brengen van een beschaafde monolaag, en data-analyse.
Om gekweekte cellen succesvol kaart, de sleutel is om een gelijkmatig verdeelde monolaag bereiden. Wanneer zaaien de cellen op de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten zijn aangegeven.
Dankbetuigingen
We willen graag Dr. Claycomb bedanken voor het verstrekken van de HL-1 cellen en gedetailleerde onderhoud protocol. We willen ook graag mevrouw Elena Carrillo en Dr Seth Robia bedanken voor hun hulp bij het genereren van de cel film en Mr. Pete Caron voor zijn hulp bij het maken van een aantal accessoires voor onze dual channel optische mapping systeem.
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 aan XA), National Institutes of Health (HL113640 aan XA), en Loyola University Research Development Fund (XA).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Rhod2 droog poeder | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluronic | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 |
Referenties
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
