Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em> Eimeria</em> כי להדביק תרנגולות

Summary

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Abstract

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm’s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Introduction

ייצור עוף עולמי גדל פי עשר במהלך 50 השנים האחרונות עם העולם המתפתח אירוח כמעט פי ארבע מההתרחבות עדים בעולם המפותח (www.faostat.org). כרלוונטי של ייצור עוף לביטחון מזון בעולם גדל כך גם יש לו את הפרופיל של פתוגנים אשר יכול לגרום למחלה קשה בתרנגולות. דוגמה בולטת הם מיני Eimeria, טפילי protozoan בכל מקום שיכול לגרום למחל coccidiosis enteric ^1. בכל מקום שתרנגולות גדלות מיני Eimeria אחד או יותר עשויים להיות נפוץ ^2-4. בעולם המפותח Eimeria נשלטים בעיקר על ידי chemoprophylaxis, העסקת תוכניות הסעות או סיבוב כדי למזער את ההשפעה של התנגדות ^5. חיסונים חיים משמשים גם במערכות שבן ערך ציפור מספיק כדי להצדיק את העלות (לדוגמא, גידול המניה, שכבות וכמה פטמים ^5). כresult הצעדים הללו coccidiosis הקליני לעתים קרובות מבוקר היטב, אם כי הזיהום תת קליני שכיח ^5. בחיסון העולם המתפתח הוא נדיר ויישום תרופה לעתים קרובות הודיע ​​פחות טוב. כתוצאה מכך coccidiosis תת-קליני והקליני הוא נפוץ יותר ומפעיל השפעה כלכלית משמעותית ^3.

אבחנה של זיהום eimerian הסתמכה באופן מסורתי על נגע הבקיע שלאחר מוות, למרות שאפילו מחברי מערכת הניקוד ביותר בשימוש נרחב בתגובה, כי לכמה מינים "זה נראה ספק אם הליך כזה צריך להיות ניסיון בכל אבל חמור מתון זיהומים" ^6. ראיות משלימות יכולות להיות שנאספו באמצעות זיהוי מיקרוסקופי של שלב מחזור החיים oocyst עמיד לסביבה בדגימות צואה או המלטה, אם כי חופף מורפולוגיה יכול לבלבל כל אבל המומחה ^6,7. חלופות מולקולריות באמצעות תגובת השרשרת של פולימראז (PCR), amplificatio האקראיn של צורות DNA PCR (RAPD-PCR) וטכנולוגיות PCR כמותי היה זמין לתקופה של עד 20 שנים ^8-10, אך עד כה הם לא הצליחו להפוך לפופולריים. חשבון יחסית והדרישה לציוד מעבדה מומחה או עיבוד מוגבל הספיגה שלהם, למרות הטבע לעתים קרובות סובייקטיבית ותובעני מבחינה טכנית של pathology- המבוגר ומבוססת מיקרוסקופיה גישות ^10,11. יכולות להיות מוגזמות מגבלות כאלה ברבים מהאזורים העניים יותר של העולם, כגון דרום מזרח אסיה, שבו ההשפעה של coccidiosis על עוני עשויה להיות גדולה יותר באופן יחסי ^12. בתגובה יש ביקוש ברור לפשוט חדשים ורגיש, אך חסכוני, מבחני אבחון Eimeria מינים ספציפיים.

הגברה בידוד התרמי (LAMP) בתיווך לולאה היא קל להכנת טכניקה מונע DNA פולימרז כי הוא מסוגל הגברת כמויות גדולות של DNA. והכי חשוב, LAMP משתמש polymera BST DNAse במקום פולימראז תקי DNA משמש בדרך כלל בPCR, המאפשר הגברה DNA בטמפרטורה קבועה יחידה ללא הדרישה לרכיבה על אופניים תרמיים ^13,14. LAMP יכול להיות נוח ליישום באפילו המעבדה הבסיסית ביותר או בתחום. Characterised על ידי התנגדות ביחס למעכבי PCR רבים, רגישות גבוהה וספציפיות, מבחני LAMP פותחו עבור מגוון רחב של פתוגנים הכוללים וירוס מחלה מדבקת bursal, perfringens Clostridium וCryptosporidium ^15-17. בתגובה לדרישה לאבחון Eimeria חסכוני מינים ספציפיים חדש פנל של מבחני LAMP ספציפיים לכל אחד משבעת המינים שEimeria להדביק תרנגולות פותח ^18. בקשות למבחנים החדשים כוללות התרחשות טפיל ניטור, של ערך מסוים נתנה את הקשר בין מינים כגון מקסימום Eimeria או necatrix Eimeria עם PE הכלכלי הירודrformance ^3,4. יישומים אחרים כוללים הערכת היעילות של אסטרטגית anticoccidial של החווה, אבחנה של דלקת תת קליניים או מחלה קלינית והערכה של הסיכון הנשקף Eimeria לחווה.

Protocol

1. תבנית הכנה הערה: כל תבנית ה- DNA הגנומי חשודה להכיל DNA נגזר מאחד משבעת המינים שEimeria להדביק תרנגולות יכולה לשמש כתבנית לזיהוי מינים מבוסס LAMP Eimeria. דגימות רקמת מעי לניתוח אבחון שדה צריכים להיות שנאספו במהלך נתיחה שלאחר המוות שגרתי כפי שמתוארים כאן. בחר הקטע (או קטעים) של מעי להיבדק. ראה בטבלת 1 מדריך לבחירת אתר לדוגמא ומיני הסיכוי הטובים ביותר להיות נוכח 18 ואיור 1 למגוון מינים ספציפיים של הפצה ומיקומם של אתרי הדגימה Eimeria. הערה: זה הוא בעל חשיבות מרכזית מאז Eimeria הוא בעיקר אתר מארח ספציפי. כל מין שמדביק תרנגולות מוגדר על ידי אזור המעיים שמטרות 19. ההחלטה עשויה להיות מושפעת מניסיון הקודם של החווה, עניין באחד או מומחדש מיני Eimeria ספציפיים או אינדיקטורים אבחון אחרים 6. סנטימטר בלו 5 או אורכים ארוכים יותר של סעיף המעיים (ים) שנבחר לבדיקת Eimeria באמצעות מספריים סטרילי או אזמל. לחלופין, לאחסן הדגימות לניתוח שלאחר מכן במקבע כמו למשל בRNAlater אתנול 18 או 95%. הערה: אם האחסון באתנול המדגם יש לשטוף ביסודיות בחומצה טריס-ethylenediaminetetraacetic סטרילי (TE) חיץ לפני השימוש. חותך את המדגם הפתוח לאורך זמן, להסיר את תוכן המעיים ביותר (אם קיימים) ולגרד תאים מהשכבה הרירית חופשיים או באמצעות הקצה של שקופית מיקרוסקופ הזכוכית סטרילית או להב מספריים אתנול / להבה מעוקרת. לחלופין למדגם במאגר כולל תאים מכל ארבעת אתרי מעיים המינים ספציפיים בצינור אחד. שים את החומר המגורד לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מיליליטר בורג העליון המכיל מאגר TE סטרילי 100 μl כולל 10% (w / v) Chelex 100 שרף. נער כל דגימת מרץ 1 דקות. ודא שהחלק העליון הבורג סגור היטב ואז דגירה באמבט מים רותח למשך 10 דקות. לאחר הרתיחה לאפשר לכל מדגם להתקרר בטמפרטורת הסביבה במשך 1-2 דקות. צנטריפוגה כל דגימה באמצעות microcentrifuge במהירות שיא (לדוגמא, XG ~ 10,000) 1 דקות. אסוף 2 μl של supernatant וכתוצאה מכך להיות תבנית בכל assay LAMP להתבצע. לחלופין, בריכה יותר מאתר אחד במעיים בצינור בודד במטרה לספק assay רב באתר. 2. Eimeria LAMP פריימר הכנה (Pre-assay) הכן מניות פריימר Eimeria LAMP הולמות עבור 100 מבחני: מחדש כל צבע יסוד Eimeria LAMP Lyophilised על ידי הוספת מים כיתה מולקולריות לריכוז של 100 מיקרומטר (כמפורט על ידי היצרן). אם לא צוין, לחשב את הנפח של usin מים הנדרשים בכיתה מולקולריתg המשקולות הפיזיות ומולקולריות של כל צבע יסוד. מים כיתה מולקולרית 60 μl פיפטה לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מיליליטר להעיף העליון נפרד לכל מיני Eimeria להיות assayed. להוסיף פריימרים FIP, BIP, F3, B3, LF וLB הספציפי ליעד מיני Eimeria למים באמצעות הכרכים מוצגים בטבלה 2, יצירת סדרה של תערובות פריימר שבעה מינים ספציפיים. בקצרה מערבולת לערבב פתרון פריימר, אז דופק microfuge ולהקפיא עד לרגע שימוש. הכן mastermix תגובת LAMP עבור כל מין Eimeria להיות assayed. להכפיל את הנפחים מוצגים בטבלה 3 במספר דוגמאות ולהוסיף שלוש עד ביקורת חיובית, שליטה שלילית וחילוף pipetting. פיפטה לתוך 0.5 או 1.5 מיליליטר להעיף עליונה צינור microcentrifuge. 3. Eimeria LAMP Assay מינים ספציפיים פיפטה 23 μl Eimeria BST DNA פולימראז / LAMP mastermix ל0.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. להוסיף תבנית 2 μl DNA (מוכנה בסעיף 1), מה שהופך סופי נפח תגובה של 25 μl. להוסיף הדנ"א הגנומי 2 μl Eimeria מינים ספציפי לתגובה אחת (ביקורת חיובית). מוסיף מים כיתה מולקולריים 2 μl לתגובה (שליטה שלילית). הערה: אם הדנ"א הגנומי מינים ספציפיים אינו זמין LAMP החיובי קודם או מוצר PCR סטנדרטי ניתן להשתמש במקום. דגירה באמבט מים או לחסום חום בגיל 62 o C למשך 30 דקות. לחלופין, דה-להפעיל את פולימראז BST DNA על ידי חימום עד 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות אם התגובה היא לא הולכת לקרוא באופן מיידי. 4. LAMP Assay קריאה מתוך בסיומו של הדגירה להעריך את הצבע של כל תגובה על ידי עין תחת אור הפנימי. תוצאות שליליות מופיעות הוורודות לסגולות בצבע, תוצאות חיוביות מופיעות שמיים כחולים 20. לחלופין, לאשר את תוצאת assay LAMP בLaboratאורי על ידי ערבוב מוצר תגובת LAMP 5 μl עם חיץ טעינת ג'ל DNA μl 1 לג'ל אלקטרופורזה agarose באמצעות ג'ל agarose 2% ב 1 x טריס Borate EDTA חיץ / / (TBE), מראש מוכתם באמצעות כתם חומצות גרעין (μl 5 ל 50 מיליליטר agarose). הוסף 5 μl של סולם ה- DNA הגודל מולקולרי 1KB לנתיב 1 של הג'ל לאפשר חישוב גודל שבר.

Representative Results

אימות assay במהלך אימות כל assay LAMP מינים ספציפיים Eimeria נבדק באמצעות פנל של דגימות DNA טהורות המייצגות את כל שבעת מיני Eimeria כי להדביק את העוף, כמו גם הדנ"א הגנומי עוף כביקורת מארח. ג'ל אלקטרופורזה agarose שימשה כדי לפתור כל assay והפגינה סגוליות מינים מוחלטים ללא תגובתיות צולבת מארח 18. בשלב הבא, פי עשר סדרת דילול סדרתי הוכנה באמצעות tenella Eimeria המטוהר הדנ"א הגנומי חשף גבול רגישות של assay בין אחת לעשרה עותקי הגנום 18. אין גבול העליון נקבע עם תוצאות טובות שהושגו עד וכוללים הריכוז הגבוה ביותר (100,000 העותקים בגנום) 18. יישום עם דגימות שדה דגימות שנאספו לבדיקת Eimeria צפויות להיגזר מתרנגולות נמצאו מת, ונבחרים כתוצאה מpoor בריאות או שלוקט למעקב בריאות זקיף, מה שמעיד על גודל מדגם סביר של בין אחת לשלוש, כאשר חלק משגרה. בדיקת שלוש ציפורים שנאספו מחווה פטם ארה"ב כחלק מתכנית מעקב הניבה שלושה סטים של דגימות מעי. ממוקד יישום של מבחני LAMP מינים ספציפיים, תוך מתן עדיף לאתרי המעיים המועדפים עבור כל מין Eimeria (טבלה 1), אפשר זיהוי חזותי של זיהום eimerian בכל ציפורים נבדק באמצעות (איור 2 א) hydroxynaphthol הכחול כאינדיקטור. הצבע שהושג עם תגובת LAMP שלילית בעת השימוש hydroxynaphthol כחולה יכול לנוע בין סגול לורוד, אבל הוא תמיד שונה מכחול מושגת על ידי תוצאה חיובית. אישור על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose סיפק תוצאות דומות (איור 2). במהלך יישום שדה המשתמש יכול לבחור ליישם את המסך המלא נגד כל שבעת המינים, או להתמקד רק אלה מינים עדיפות כחשוב או ידוע להיות במחזור בחווה או סביבתה. הכישלון של גישות המבוססות על PCR להתבסס כאבחון להתרחשות של Eimeria מדגישה את הדרישה לפשטות בכל מבחן חדש. בעוד LAMP מציע הכנה פשוטה ועיבוד מ PCR, החובה לבחון אתרי מעיים מרובים לכל ציפור נשארה מייאשת. ייצור של מדגם יחיד במאגר ה- DNA לכל ציפור, אשר לאחר מכן ניתן לבדוק עם מבחני LAMP אחד או יותר, עשוי להיות מושך יותר. עיבוד מדגם במאגר אחד לכל ציפור, המייצג את החומר שנאסף מכל אחד מאתרי מעיים הספציפיים מתוארים בטבלה 1 ויקוו לפני הכנת DNA, לבדיקה עם כל שבעת מבחני LAMP סיפק את אותה התוצאה כמו בעת כל אתר מעיים היה מעובד בנפרד (איור 2 לעומת איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig1.jpg" /> איור 1. אתרי דגימת מעיים לגילוי LAMP של טפילי מיני Eimeria להדביק תרנגולות. האזורים במעי הממוקדים על ידי כל מיני Eimeria מודגש על ידי הקווים בצבע, עם האתרים המועדפים של דגימה מצויינים על ידי המספר בין הקווים השחורים המקווקו (א ' acervulina: / 1, Brunetti הצהוב E.: / ורוד 2, מקסימום E.: כחול / 3, mitis א: / 4, necatrix הכתום E.: אדום / 5, praecox א: / ירוק 6 וtenella א: אפור / 7). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אבחון 2. מנורת איור של זיהום eimerian הלוך ושובשלוש תרנגולות מ 'מסחריות פטם. תגובות LAMP נפתרו באמצעות () hydroxynaphthol כחולות, שבו תגובה כחולה שמים הייתה חיובית וסגולה לתגובה הוורודה היה שלילי, וג'ל אלקטרופורזה agarose (B). אתרי המעיים נדגמו כפי שמוצגים בטבלה 1 עבור כל מין טפיל. = E. acervulina, B = E. Brunetti, מא = E. מקסימום, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox וT = E. tenella. ליין 1 מכיל סולם GeneRuler 1KB DNA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אבחון 3. מנורת איור של זיהום eimerian באמצעות נקווה דגימות משלושה עופות פטם מסחריים נפרדים. reac LAMPמשא ונפתר באמצעות כחול hydroxynaphthol, שבו תגובה כחולה שמים הייתה חיובית וסגולות לתגובה הוורודה היה שלילי. = E. acervulina, B = E. Brunetti, מא = E. מקסימום, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox וT = E. tenella. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אתר לדוגמא assay מיני Eimeria (סביר להניח) תריסריון (D) acervulina E., praecox E. מעי ריק / מעי * (J / I) א 'מקסימום, necatrix E. Caeca (C) necatrix E., tenella E. מעי Terminal (TI) Brunetti E., mitis E. </tr> מדגם יקווה (P) acervulina E., Brunetti א, א מקסימום, mitis E., necatrix E., praecox E., tenella E. טבלת 1. בחירת מעיים אזור ספציפי של מבחני מיני המועמד Eimeria. הבחירה של אזור שתדגם משתנה עבור כל מין Eimeria כפי שמודגם באיור 1. דגימות נקוו כוללות חומר שנאסף מכל ארבעת האתרים הספציפיים שאוחדו לאחר מכן להכנת DNA. * פריימר ריכוז מניות (מיקרומטר) נפח (μl) מים – 60 קדימה הפנימי פריימר (FIP) 100 40 אחורה פנימי פריmer (BIP) 100 40 קדימה החיצוני פריימר (F3) 100 10 אחורה החיצוני פריימר (B3) 100 10 לולאה קדמית (LF) 100 20 לולאה לאחור (LB) 100 20 סה"כ 200 הכנת טבלה 2. premix פריימר LAMP. הרכיבים והפרופורציות יידרשו להכין premix פריימר לLAMP. כרכים המוצגים הם עבור 100 תגובות LAMP. * זהויות פריימר כפי שמוצג בחומרים וBarkway et al (2011) 18. n קונצרט כלשהו המניה n קונצרט כלשהו התגובה האחרונה נפח לכל תגובה (μl) DDW – – 10.1 מאגר ThermoPol 10 x 1 x 2.5 4 MgSO 100 מ"מ 2 מ"מ 0.5 תערובת פריימר * טבלה 2 2.5 dNTPs 25 מ"מ 400 אום 0.4 Betaine 5 M 1 M 5 Hydroxynaphthol כחול 3 מ"מ 120 מיקרומטר 1 פולימראז BST DNA 8,000 U / ml 8 U 1 סה"כ 23 הכנת לוח 3. לאםmastermix תגובת P. * Eimeria מינים ספציפיים.

Discussion

The Eimeria species-specific LAMP assays described in this paper offer a new diagnostic tool kit in support of effective control of coccidia and the disease coccidiosis. The outcomes of eimerian infection can include severe economic loss as well as seriously compromised bird welfare and increased susceptibility to colonisation by zoonotic pathogens²¹. Opportunities to monitor flocks for the occurrence of some, or all Eimeria species can provide early warning of a breakdown in anticoccidial control efficacy. Key advantages of LAMP include robust target specificity, resulting from the requirement for six different DNA sequence targets, as well as high sensitivity, boosted by the inclusion of loop primers¹³, although the qualitative, not quantitative nature of LAMP may be considered a limitation. It is not currently possible to discriminate low level parasite escape from routine chemoprophylaxis or live vaccine replication from unchecked eimerian replication. Nonetheless, the technical ease of the protocol and definitive readout offers considerable improvement over the existing specialist and frequently subjective pathology- and morphology-led approaches^6,7. Each assay may be completed at a cost of ~£0.75 per sample, independent of labour and equipment set up expenses. Thus, LAMP assays are also more cost effective than other molecular diagnostics such as PCR, since they require an isothermal incubation with no need for specialist equipment.

For many years access to Eimeria genomic DNA as template has limited the development and application of molecular field diagnostics. The oocyst is the most readily accessible phase of the eimerian lifecycle, but routine DNA extraction requires laboratory facilities²². Other, more labile intestinal lifecycle stages require purification prior to DNA preparation to prevent PCR inhibition and a consequent loss of sensitivity^23,24. The ability to extract eimerian DNA of a quality suitable for LAMP using equipment no more specialised than a microcentrifuge and a water bath, supplemented by inhibitor adsorption using chelex resin, now promotes the wider use of molecular biology in eimerian diagnostics. Intriguingly, the reported detection of quantitative PCR-measurable Eimeria DNA in intestinal tissue 20 days after the initiation of parasite infection, 11 days after the last detectable oocyst output, raises the suggestion that LAMP may be used to detect resolved parasite exposure as well as ongoing infection, even after any visible lesions may have been resolved²⁵.

The relatively low cost and low technical requirements of LAMP Eimeria diagnostics can promote their application in the developing world where other more established approaches may not be available or appropriate. For this to be applicable each assay must be capable of detecting all strains which may be circulating within each region. While understanding of the genetic diversity prevailing among Eimeria species is limited²⁶, the use of target sequences previously validated for use in quantitative PCR with strains from Africa, Asia, Europe and South America provides some evidence of conservation, supporting the utility of these LAMP assays around the world¹⁰.

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments
RNAlater	Ambion	AM7024
Ethanol	VWR Chemicals	20821.321	Caution, highly flammable
100 x Tris-EDTA (TE) buffer concentrate	Sigma-Aldrich	T9285
Chelex 100 resin	Bio-Rad	142-1253
Molecular grade water	Invitrogen	10977035
E. acervulina F3	Sigma-Aldrich	VC00021	*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC
E. acervulina B3	Sigma-Aldrich	VC00021	*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG
E. acervulina FIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT
E. acervulina BIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG
E. acervulina LB	Sigma-Aldrich	VC00021	*TAAGGTTACACCCGTGGAGG
E. acervulina LF	Sigma-Aldrich	VC00021	*GCCATGCACAAAGCGACTT
E. brunetti F3	Sigma-Aldrich	VC00021	*GGCCATCAAGTTCCATGAGC
E. brunetti B3	Sigma-Aldrich	VC00021	*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT
E. brunetti FIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT
E. brunetti BIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC
E. brunetti LB	Sigma-Aldrich	VC00021	*GAAACGCTCGAACATGGC
E. brunetti LF	Sigma-Aldrich	VC00021	*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT
E. maxima F3	Sigma-Aldrich	VC00021	*ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT
E. maxima B3	Sigma-Aldrich	VC00021	*CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG
E. maxima FIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG
E. maxima BIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA
E. maxima LB	Sigma-Aldrich	VC00021	*CAAGCCTACGCGGACATC
E. maxima LF	Sigma-Aldrich	VC00021	*TTATGCAGCTGGGTCAACG
E. mitis F3	Sigma-Aldrich	VC00021	*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG
E. mitis B3	Sigma-Aldrich	VC00021	*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA
E. mitis FIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT
E. mitis BIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG
E. mitis LB	Sigma-Aldrich	VC00021	*TCCATGCATCCCCTTGTT
E. mitis LF	Sigma-Aldrich	VC00021	*CGTGGGCACAGATTGATTC
E. necatrix F3	Sigma-Aldrich	VC00021	*TGGCTTTCCCGCGTACC
E. necatrix B3	Sigma-Aldrich	VC00021	*CGGCCCAACACAAAGACTG
E. necatrix FIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA
E. necatrix BIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC
E. necatrix LB	Sigma-Aldrich	VC00021	*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT
E. necatrix LF	Sigma-Aldrich	VC00021	*GAACAGCCGGAGCCTCTC
E. praecox F3	Sigma-Aldrich	VC00021	*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT
E. praecox B3	Sigma-Aldrich	VC00021	*GCGCACGAATCTGAATCACAC
E. praecox FIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG
E. praecox BIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT
E. praecox LB	Sigma-Aldrich	VC00021	*GAATAGCATTGCCAGGTGG
E. praecox LF	Sigma-Aldrich	VC00021	*GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC
E. tenella F3	Sigma-Aldrich	VC00021	*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG
E. tenella B3	Sigma-Aldrich	VC00021	*GCTGAGTCCATACGTACTTCCT
E. tenella FIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT
E. tenella BIP	Sigma-Aldrich	VC00021	*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT
E. tenella LB	Sigma-Aldrich	VC00021	*CGCATGTGCAGTTGAAGACA
E. tenella LF	Sigma-Aldrich	VC00021	*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG
10 x ThermoPol reaction buffer	New England Biolabs	B9004S
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
dNTPs	Promega	U1330
Betaine solution (5 M)	Sigma-Aldrich	B0300
Bst polymerase	New England Biolabs	M0275S
Hydroxynaphthol blue	Sigma-Aldrich	33936	Dissolved in molecular grade water.
UltraPure agarose	Invitrogen	16500-500
10 x Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer	Invitrogen	AM9863
Blue/Orange DNA loading dye (x6)	Promega	G1881
GeneRuler 1Kb DNA ladder	Thermo Scientific	SM0313
SafeView nucleic acid stain	NBS Biologicals	NBS-SV