Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em> Ex Vivo</em> Культура клеток
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
Человеческой кожи имеет важную барьерную функцию, и содержит различные иммунные клетки, которые вносят вклад в гомеостаз ткани и защиты от патогенных микроорганизмов. Поскольку кожа является относительно легко получить доступ, он обеспечивает идеальную платформу для изучения периферические механизмы иммунных регуляторных. Иммунные клетки резидентные у здоровых поведения кожи иммунологического, но и играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз. Несмотря на возникающие идеи, наше понимание биологии, лежащей в основе различных воспалительных заболеваний кожи по-прежнему ограничено. Существует необходимость для хорошего качества населения (одиночный) клеток, выделенных из образцов биопсии кожи. До сих пор процедуры изоляции были серьезно затруднена из-за отсутствия получения достаточного количества жизнеспособных клеток. Выделение и последующий анализ также пострадали от потери иммунных маркеров клеточной линии дифференцировки, из-за механического и химического стресса, вызванного существующими процедурами диссоциации, чтобы получитьодноклеточной суспензии. Здесь мы опишем модифицированный метод для выделения Т-клеток от обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем сочетания механической диссоциации кожи с использованием автоматизированной диссоциатор тканей и лечения коллагеназы. Эта методика сохраняет экспрессию большинства маркеров иммунной линии дифференцировки, таких как CD4, CD8, Foxp3 и CD11c при приготовлении одноклеточных суспензий. Примеры успешного выделения клеток CD4 + T и последующего фенотипических и функционального анализа показаны.
Introduction
Кожа, в качестве основного интерфейса между телом и окружающей средой, обеспечивает первую линию защиты от внешних физических, химических и биологических оскорблений, таких как язву ультрафиолетового излучения и микроорганизмов. Кожа состоит из двух основных отделения, эпидермис и дерму, и содержит множество иммунных клеток , включая клетки Лангерганса, макрофаги, дендритные клетки (ДК) и около 20 миллиардов Т – клеток памяти, почти в два раза больше числа присутствующих во всем объеме крови 1 , 2. Все больше данных поддерживает идею о том, что кожа имеет существенные иммунологические функции, как во время гомеостаза тканей и при различных патологических состояниях. Иммунные клетки резидентные в нормальной коже , как полагают, проводят иммунологического 3 и было показано, играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний , таких как псориаз 4. В псориатической пораженной кожи, и CD4 + и CD8 + Т – клетки проникали были наблerved и показано , что отношение CD4 и CD8 варьирует в зависимости от состояния заболевания 5. Тем не менее, эти популяции клеток трудно изучать, так как существующие методы позволяют изолировать только несколько клеток.
В настоящее время широко используются методы для выделения Т-клеток из человеческой кожи сочетают механическую диссоциацию кожи с ферментативной обработкой. Биопсий кожи человека широко фарша и инкубировали с ферментами , такими как трипсин, коллагеназа и / или ЭДТА 6-8. Принимая во внимание , что кожа является барьером ткани , которая обладает высокой устойчивостью к растягивающих сил и механической дезагрегации, установленные методы выделения Т – клеток получают очень мало клеток, и даже более низкие количества жизнеспособных клеток, что делает ех Vivo культуры клеток этих клеточных популяций трудно и испытывающий.
Здесь мы сообщаем модифицированный метод для выделения лимфоцитов из обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем объединения Mechanскую диссоциация кожи с использованием автоматизированной диссоциатор ткани вместо установленного метода широко мясорубки вместе с ферментативное расщепление с помощью коллагеназы. Различные жизнеспособные подмножества иммунных клеток, включая контроллеры домена и Т-клетки наблюдались после приготовления одной клеточной суспензии. Важно, что экспрессия поверхностных маркеров CD3, CD4 и CD8 хорошо сохранился. Клетки , полученные таким способом, будут готовы к использованию в бывших клеточных культурах или естественных условиях анализа проточной цитометрии. Этот протокол был успешно применен для анализа единичных биоптатах кожи (4 мм), полученные из повреждений кожи у пациентов с псориазом. Результаты показали , что кожа пациента житель Т – клетки получают более провоспалительных цитокинов , таких как IL-17 и IFN & gamma ; по сравнению со здоровыми добровольцами 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим протокол, чтобы эффективно изолировать резидентные кожи Т-клеток из биопсий кожи человека. Преимуществом этого протокола является выделение относительно большого числа жизнеспособных лимфоцитов, экспрессирующих и соответствующие поверхностные маркеры. Подмножес?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
биопсии кожи у пациентов с псориазом были любезно предоставлены доктором Андреасом Koerber (дерматологии отдела в Университете г. Эссен, Германия) после устного или письменного информированного согласия для научного использования.
XH также поддерживается NSFC 61263039 и 11101321 NSFC.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
