Mosaico de pez cebra transgénesis de Análisis Genómica Funcional de candidatos genes cooperativos en la patogénesis del tumor

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Los cánceres son enfermedades progresivas marcados por la acumulación de mutaciones patológicas, deleciones y ganancias cromosómicas con el tiempo. Estas anomalías genéticas pueden afectar a múltiples procesos celulares que van desde el ciclo celular, la muerte celular, el metabolismo energético y el montaje del citoesqueleto a respuestas de estrés tales como hipoxia. Por lo tanto, la tumorigénesis refleja las acciones colectivas de múltiples aberraciones genéticas a través de un espectro de procesos biológicos. Los recientes esfuerzos de integración genómica de investigación, incluyendo la secuenciación de todo el genoma, la secuenciación del exoma, secuenciación dirigida, secuenciación profunda y estudios de asociación del genoma, han identificado un número cada vez mayor de alteraciones genéticas novedosas en prácticamente todos los tipos de tumores ^1-4. En muchos casos, las lesiones genéticas ocurren juntos de una manera no aleatoria ^5-8, lo que sugiere su cooperación en la patogénesis de la enfermedad. La disección de las funciones oncogénicas de la gran variedad de genes aberrantemente expresadas resultantes fesde estas lesiones genómicas es necesario diseñar nuevas estrategias terapéuticas y de entender las respuestas de las células tumorales a estos agentes, pero esto ha demostrado ser una tarea de enormes proporciones, que requiere muy robustos sistemas de modelos animales para la conducción de alto rendimiento de análisis genómico funcional en vivo.

Aunque los mamíferos, especialmente roedores, son modelos favorecidos en la biología del cáncer, el pez cebra ha comenzado a atraer una atención considerable. El pez cebra teleósteos (Darío rerio) se ha utilizado como un organismo modelo para el estudio de desarrollo desde la década de 1960 y fue aplicado primero al estudio de la patogénesis del tumor en 1982 ^9-11. Facilidad de mantenimiento, pequeño tamaño del cuerpo, y la alta fecundidad hacen que el pez cebra un modelo sólido para pantallas adelante genéticos a gran escala para identificar las mutaciones que confieren fenotipos anormales y patológicas ^10. La transparencia óptica de embriones de pez cebra es otra característica clave de apoyo a un mayor uso de este modelo de cáncer, comopermite de imágenes in vivo para ser llevado a cabo para localizar el desarrollo de tumores en tiempo real ^9, una aplicación que es relativamente difícil en roedores ^12. Recientes genómica comparativa análisis del genoma de referencia pez cebra (Zv9) reveló 26.206 genes codificadores de proteínas, con un 71% que tiene ortólogos humanos, de los cuales 82% están relacionados con los genes asociados a la enfermedad de la herencia mendeliana en línea en Man (OMIM) base de datos ^{13, 14.} En consecuencia, el pez cebra se ha utilizado para modelar diversos tipos de cánceres humanos, incluyendo neuroblastoma ^8, de células T de la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) ^{15,16, 17,18} melanoma, sarcoma de Ewing ^19, rabdomiosarcoma ^20,21, carcinoma de páncreas ^{22, 23} y carcinoma hepatocelular mieloides malignas ^24,25, y ha sido seleccionado como un modelo de cáncer de xenotrasplantes estudia ^11,26.

A transgénicas establesenfoque en el pez cebra se utiliza comúnmente para estudiar el efecto de ganancia de la función de los genes en el desarrollo normal o patogénesis de la enfermedad ^27,28. Para desarrollar tal un modelo (Figura 1A), se inyecta una construcción de ADN que contiene el gen de interés dirigido por un promotor específico de tejido en una de las células de tipo salvaje embriones. Tres o cuatro meses después de la inyección, cuando los embriones inyectados alcanzan la madurez sexual, se outcrossed con el tipo salvaje de pescado para detectar los que muestran la integración de la construcción de ADN en su línea germinal, lo que les otorga licencias como peces fundador. Muchos factores, tales como el número de copias y el sitio de integración del transgén, afectan a la expresión del transgén en las líneas transgénicas estables. Por lo tanto, para desarrollar un modelo de tumor transgénico, múltiples líneas transgénicas estables que sobreexpresan un único oncogén tienen que ser generada primero y proyectado para la línea que expresa el transgén en un nivel que podría conducir a la inducción de tumores. Sin embargo, si la sobreexpresión de una o candidatoncogene es tóxico para las células germinales, es difícil generar una línea transgénica estable mediante la sobreexpresión directamente el transgén ^29. Por lo tanto, este enfoque puede llevar mucho tiempo, con un alto riesgo de fracaso para generar un modelo de cáncer adecuado.

Aquí, se ilustra una estrategia alternativa basada en la transgénesis transitoria mosaico (Figura 1B) que proporciona ventajas únicas sobre la transgénesis estable tradicional para estudio genómico funcional in vivo. En este enfoque, una o más construcciones transgénicas se inyectan en la fase de una célula de transgénicos o de tipo salvaje embriones. Las construcciones de ADN inyectados contienen transgenes son entonces mosaically y aleatoriamente integradas en el pescado primaria inyectada, lo que resulta en una mezcla de genotipos en múltiples poblaciones celulares en peces individuales ^30. Además, la coinyección de ADN múltiples constructos en embriones de una sola célula conduce a co-integración en la misma célula en sitios al azar, que permite a uno TRAce las células con expresión de los transgenes y explorar las interacciones de los diferentes genes durante la patogénesis de la enfermedad en los animales de mosaico ^31. Como prueba de principio, transitoriamente overexpressed ALK mutacionalmente activado (F1174L) con el gen reportero mCherry en el sistema nervioso simpático periférico (SNPS) bajo control de la hidroxilasa beta dopamina (d βh) promotor de tipo salvaje pescado y peces transgénicos que sobreexpresan MYCN. ALK, que codifica un receptor tirosina quinasa, es el gen más frecuentemente mutado en neuroblastoma de alto riesgo ^5-7,32,33. ALK (F1174L), como una de las mutaciones somáticas activación más frecuentes y potentes, es sobre-representado en MYCN- amplificado pacientes con neuroblastoma de alto riesgo y la sinergia con sobreexpresión MYCN para acelerar la tumorigénesis neuroblastoma en ratones transgénicos estables y modelos de pez cebra transgénico ^8,34,35. Por mosaicola sobreexpresión transitoria de ALK (F1174L) con mCherry en el pez transgénico MYCN, que recapitula la aceleración de la aparición del tumor observado en los peces transgénicos estables que sobreexpresan tanto ALK (F1174L) y MYCN, lo que sugiere que la estrategia de la transgénesis de mosaico se puede utilizar para rápida y eficiente evaluar las contribuciones relativas de varios oncogenes en la iniciación del tumor in vivo.

Protocol

NOTA: Todos los estudios de pez cebra y el mantenimiento de los animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el IACUC Clínica Mayo Institute # A41213. 1. Construcciones de DNA para la transgénesis Amplificar una 5,2-kb beta hidroxilasa de dopamina (d βh) región promotora 8 usando el clon BAC CH211-270H11 (desde el centro de recursos BACPAC (BPRC)) como plantilla de ADN. Utilice una los programas de ciclos siguientes para la PCR PCR sistem…

Representative Results

Para investigar si la sobreexpresión de F1174L ALK mutationally activado o de tipo salvaje ALK podría colaborar con MYCN en la inducción de neuroblastoma, overexpressed ya sea ALK activada humana o de tipo salvaje ALK humano bajo el control del promotor d βh en el PSNS de peces transgénicos que sobreexpresan MYCN. Cualquiera de las siguientes construcciones, dβh – ALKF1174L o dβh – ALKWT, fueron coinjected con d…

Discussion

En este estudio representativo, se utilizó coinyección transitoria y coexpresión de ALK activado con el gen reportero mCherry en MYCN expresando peces transgénicos para mostrar que estos genes cooperan para acelerar notablemente la aparición de neuroblastoma, coherente con nuestra conclusión anterior en el compuesto estable que coexpresan los peces transgénicos tanto ALK y MYCN ⁸ activado. Este enfoque transgénico mosaico posee varias ventajas sobre el mét…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY