Analyse av Autophagy i<em> Penicillium chrysogenum</em> Ved hjelp av Sult Pads i kombinasjon med Fluorescensmikroskopi

Summary

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Abstract

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introduction

Trådformede sopper er gode modellsystem for å studere utviklingsprosesser. De tilbyr flere eksperimentelle fordeler som billig dyrking, høyt antall avkom og genetisk tilgjengelighet. Det siste punktet er av særlig relevans for bygging av transformanter som tillater undersøker betydningen av så-langt uncharacterized gener for ulike cellulære mekanismer. Filamentøse fungi har vært medvirkende til belysning av flere elementer og mekanismer for cellulære kvalitetskontroll trasé som protease-aktivitet for nedbrytning av avvikende proteiner, mitokondrie dynamikk for å opprettholde integriteten og mitokondrielle autophagy for fjerning av overskudd og / eller dårlig fungerende cellekomponenter, og for å opprettholde celle levedyktighet i tider med sult ^1,2,3.

Det er flere eksperimentelle teknikker tilgjengelig for studiet av autofagi i trådformede sopp ^2: (i) undersøkelse av vakuoler jegf de inneholder tette autophagic organer når proteaser er hemmet ved transmisjonselektronmikroskopi ^4, (ii) visualisering av autophagosomes ved å overvåke GFP-Atg8 foci via fluorescensmikroskopi ^5,6 og (iii) påvisning av forsurede autophagosomal strukturer ved hjelp av fluorescerende fargestoff monodansyl cadaverine ^7.

Her blir en ny fremgangsmåte til å vokse Penicillium chrysogenum for Autophagy studier presentert. Hovedelementet er "sult pad" som bare består av 1% agarose oppløst i sterilisert vann fra springen. Ytterligere forbindelser (for eksempel stressfaktorer, åtseldyr, autofagi modulatorer) kan legges til puten, så lenge de ikke viser auto-fluorescens. Puten ligger i objektglass som inneholder en grunne sentrale hulrom. Denne puten i inokulert enten med en spore suspensjon eller med små mycel fragmenter. Sistnevnte er tilrådelig hvis belastningen av interesse unnlater å sporulate effektivt (f.eks Δ atg1 stammer ^8). Skinnene er plassert i våte kamre (disse kan lett konstrueres ved å bruke tomme pipettes bokser) for å hindre uttørking av prøve og inkubert ved værelsestemperatur. P. chrysogenum er i stand til å vokse i noen dager under disse betingelser. Autofagi kan observeres mikroskopisk ved vacuolar utvidelse som er en positiv markør for sopp autofagi. I dette bidraget, en P. chrysogenum stamme (Wisconsin 54-1255) brukes som danner grønt fluorescerende protein som er målrettet mot peroxisomes av sin C-terminal "SKL 'sekvens ^9. Derfor er det mulig å overvåke nedbrytningen av peroxisomes. Det er mulig å merke også andre i cellen (f.eks mitokondrier) ved hjelp av hensiktsmessige lokaliseringssignaler, og for å analysere deres nedbrytning. Selv om data fra P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) er presentert her, det er absolutt muligå bruke "sult pad" metoden også for andre trådformede sopper (f.eks Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus arter, etc.).

Protocol

1. Utarbeidelse av P. chrysogenum for Sult Eksperimenter Hvis P. chrysogenum stamme av interesse holdes på ris ("grønn ris '), plasserer 2-3 riskorn dekket med sporedannende mycel i en 1,5 ml mikro tube. Fylle det med 500 ul YGG (10 g / l KCl, 20 g / l glukose, 10 g / l gjærnitrogenbase, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l gjærekstrakt). Vortex røret i 30 sekunder slik at sporer kan løsne fra ris effektivt. Inkuber røret i 1 dag ved romtempera…

Representative Results

For å demonstrere nytten av protokollen beskrevet ovenfor peroksisom nedbrytning i P. chrysogenum belastning Ws54-1255 (GFP-SKL) ble analysert. I denne belastningen GFP-SKL er vanligvis importert til peroxisomes 9. Dette resulterer i fremkomsten av flere sfæriske formene når prøven blir analysert via fluorescens mikroskopi. Hvis autofagi skjer, vakuoler forstørre. GFP-SKL blir innlemmet i vakuoler ved autofagi (pexophagy). På grunn av det faktum at GFP er motstandsdyktig mot nedbrytning ved vak…

Discussion

Metoden som presenteres her tillater praktisk og reproduserbar studie av autofagi i P. chrysogenum. For eksempel kan den brukes til screening av effekten av forskjellige forbindelser enten de er i stand til å modulere autophagy responsen av denne sopp eller ikke. Resultatene med rapamycin viser at inhibering av TOR-signalering fører til en markert induksjon av autofagi i P. chrysogenum som har også blitt demonstrert for andre organismer ^11.

Det er mulig å bru…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 – 0.50 mm