Analyse de l'autophagie dans<em> Penicillium chrysogenum</em> À l'aide de famine Pads en association avec microscopie de fluorescence
Summary
A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.
Abstract
The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.
Introduction
Les champignons filamenteux sont d'excellents systèmes modèles pour l'étude des processus de développement. Ils offrent plusieurs avantages expérimentaux comme la culture pas cher, un grand nombre de descendants et l'accessibilité génétique. Le dernier point est particulièrement important pour la construction de transformants qui permettent enquête l'importance des gènes so-far non caractérisées pour divers mécanismes cellulaires. Les champignons filamenteux ont joué un rôle pour l'élucidation de plusieurs éléments et les mécanismes de voies cellulaires de contrôle de la qualité comme l'activité de la protéase de la dégradation des protéines aberrantes, la dynamique mitochondriale pour maintenir l'intégrité mitochondriale et l'autophagie pour l'élimination de l'excédent et / ou des composants cellulaires dysfonctionnelles et pour le maintien la viabilité des cellules en temps de famine 1,2,3.
Il existe plusieurs techniques expérimentales disponibles pour l'étude de l'autophagie dans champignons filamenteux 2: (i) l'étude des vacuoles if ils contiennent des corps autophagiques denses lorsque proteases sont inhibées par microscopie électronique à transmission 4, (ii) visualisation de autophagosomes en surveillant GFP-Atg8 foyers par microscopie de fluorescence 5,6 et (iii) la détection des structures de autophagosomal acidifiés à l'aide du colorant fluorescent monodansyl cadavérine 7.
Ici, une nouvelle méthode de Penicillium chrysogenum croissante pour les études de l'autophagie est présenté. L'élément principal est le «pad de famine», qui consiste simplement à 1% d'agarose dissous dans l'eau du robinet stérilisée. Des composés supplémentaires (par exemple, les facteurs de stress, des charognards, des modulateurs de l'autophagie) peuvent être ajoutés au pad tant qu'ils ne se affichent pas auto-fluorescence. Le tampon est situé dans des lames de microscope qui contiennent une cavité centrale peu profonde. Ce coussin en inoculé soit avec une suspension de spores ou de petits fragments de mycélium. Ce dernier est conseillé si la souche d'intérêt ne sporulate efficacement (par exemple, les souches de ATG1 Δ 8). Les lames sont placées dans des chambres humides (ceux-ci peuvent être facilement construits en utilisant des boîtes vides pointe de pipette) pour empêcher la dessiccation de l'échantillon et on incube à la température ambiante. P. chrysogenum est capable de croître pendant quelques jours dans ces conditions. L'autophagie peut être observée au microscope par l'élargissement vacuolaire qui est un marqueur positif pour l'autophagie fongique. Dans cette contribution, un P. chrysogenum souche (Wisconsin 54-1255) est utilisé qui forme une protéine fluorescente verte qui est ciblé vers les peroxysomes par sa séquence C-terminale 'SKL «9. Par conséquent, il est possible de surveiller la dégradation des peroxysomes. Il est possible de marquer également d'autres compartiments de la cellule (par exemple, les mitochondries) en utilisant des signaux de localisation appropriés et pour analyser leur dégradation. Bien que les données de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) est présenté ici, il est certainement possibled'utiliser la méthode du «tapis de famine» aussi pour d'autres champignons filamenteux (par exemple, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, les espèces d'Aspergillus, etc.).
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici permet l'étude pratique et reproductible de l'autophagie dans P. chrysogenum. Par exemple, il peut être utilisé pour le criblage de l'efficacité des différents composés se ils sont capables de moduler la réponse de l'autophagie de ce champignon ou non. Les résultats démontrent que la rapamycine avec inhibition de la signalisation TOR conduit à une induction marquée de l'autophagie dans P. chrysogenum qui a également été démontré pour d'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CQS receives a fellowship from the LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). The author would like to thank Ida J. van der Klei for the P. chrysogenum strains used in this work and Andreas S. Reichert for the gift of rapamycin.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 – 0.50 mm |
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