筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング
Summary
Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.
Abstract
タンパク質変異体は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病におけるα-シヌクレインおよびアルツハイマー病におけるβアミロイドおよびタウにおけるTDP-43を含む多くの疾患において重要な役割を果たしているので、選択的に標的とすることができる形態学的試薬を開発することが非常に重要であるこれらの疾患特異的タンパク質が疾患の病状および潜在的な診断および治療用途のためにこれらの変異体の役割を研究する変異体である。我々は、選択的に、疾患特異的タンパク質の変異体を認識する試薬の単離を可能にする新規の原子間力顕微鏡（AFM）ベースのバイオパニング技術を開発した。プロセスに関与する2つの主要な相、負および正のパニング段階がある。負のパン·フェーズでは、オフターゲット抗原に反応性のあるファージは、厳選されたオフターゲット抗原の一連を利用し、サブトラクティブパニングの複数ラウンドを排除している。負の重要な機能パニング段階プロセスを監視し、すべての望ましくないファージ粒子が除去されていることを確認するために、AFMイメージングを利用している。正のパニング段階のために、関心対象の標的抗原は、雲母表面上に固定され、結合したファージを溶出させ、選択的に標的抗原に結合するファージを同定するためにスクリーニングされる。標的タンパク質の変異体は、適切な負のパンコントロールが使用されている提供精製する必要はない。複雑な生物学的物質に非常に低い濃度でのみ存在するタンパク質変異体は、正のパニング段階で利用することができるターゲット。この技術を適用することにより、我々は選択的に、人間のALSの脳組織に見られるTDP-43のタンパク質変異体に対する抗体を獲得した。我々は、このプロトコルは、選択的に異なる生物学的プロセスおよび疾患の多種多様に存在するタンパク質の変異体に結合する試薬を生成することに適用可能であるべきであることを期待する。
Introduction
タンパク質変異体の存在は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALSおよび前頭側頭型認知症（FTD）1,2,3,4,5,6,7,8,9などの神経変性疾患を含む多くの疾患の進行の要因として関与している、10,11。タンパク質βアミロイドおよびα-シヌクレインのオリゴマー形態は、それぞれ2,3,4,5、アルツハイマー病及びパーキンソン病の原因で有毒種であると考えられている。 TAR DNA結合タンパク質43（TDP-43）の凝集体は、ALSとFTD 12,13,14にリンクされている。したがってそのような選択的に異なるタンパク質変異体は、診断マーカーおよび潜在的な治療薬として機能するための強力なツールであることができるターゲットにすることができる抗体などの試薬。本研究では、しかし、本論文で概説技術はprotの広い範囲に対して、試薬の分離に適用可能であるべきである、選択的にALSに関与TDP-43タンパク質の変異体を結合した試薬の開発に注力EIN変種。
TDP-43の細胞質の凝集は、ALS 15,16,17,18,19における病理学的特徴として同定されている。これは、サイトゾルおよび核15,17間を移動する傾向があるが、典型的にTDP-43は、正常な個体からのすべての細胞の核内に見出される。しかし、ALSにTDP-43の形態は、疾患の進行16,20の間に核から細胞質へのTDP-43の動きを示唆して核内に見つかったより低い濃度で選択したニューロンとグリアの細胞質で検出された集約。 TDP-43の凝集がALS症例の大多数において見出されているが、1％-2合計ALS症例の％（または家族性ALS症例の15％-20％）の変異にリンクされているので、すべての場合を考慮していないスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）遺伝子15,17。そのためALS症例の大多数においてTDP-43の重要な役割のために、ここでは選択的にTDP-43変異体にも結合することができる抗体ベースの試薬の開発に注力私たちの小説AFMベースのバイオパニング技術を利用して、人間のALSの脳組織に存在する。
当初我々は、抗体結合ドメインの多様なレパートリーを必要としています。我々は、3つの異なるファージディスプレイ単鎖可変ドメイン抗体フラグメント（scFvの）ライブラリ（トムリンソンIとJとシートライブラリ21）を合わせた。パニングプロセスは、負および正のパニング段階に分けられる。ライブラリーからのファージを、最初に、複数のオフターゲット抗原が排除されるに反応するファージその間ネガティブパニングプロセスに供される。各オフターゲット抗原に対するネガティブパニングの各ラウンドが終了した後、プロセスは、オフターゲット抗原に結合する全てのファージが除去されたことを確認するためにAFMイメージングによってモニターされる。のみすべての反応性のファージを除去したAFMイメージングによって確認した後、我々は次の目標に進んでください。 ALSに関与TDP-43の変種に対する試薬を分離するために、我々は以下の負のパンニングの抗原を利用：タンパク質に弱く又は非特異的に結合するファージを除去するための1）BSA。凝集したタンパク質のジェネリック構造要素に結合するファージを除去するための2）凝集したα-シヌクレイン。 3）ヒト脳組織ホモジネートは、任意のタンパク質または健康なヒトの脳組織の死後のサンプル中に存在する他の成分に結合するファージを除去する。 4）健康なヒトの脳に関連するすべてのTDP-43のフォームに結合するファージを除去するために健康なヒトの脳からTDP-43を免疫沈降した。 5）非ALSの病態に関連TDP-43変異体を結合するファージを除去するためにFTD脳ホモジネートからTDP-43の単離された免疫沈降した。すべてのオフターゲット抗原に対する反応性のすべてのファージを除去した後、我々は、この場合には、TDP-43は、ヒトのALS脳組織から免疫沈降し、目的の抗原に結合する抗体断片が単離され、その間に正のパニング段階に進む。これらの単離された抗体は、TDP-43の集約または改変された形態への反応性であり得る。
">従来のファージパニングは正のパニング段階22,23に主に焦点を当てている。通常、目的の標的が固定化され、ファージライブラリーを添加し、結合したファージは、この増幅は、インキュベーション工程をファージを次に増幅される。溶出し、再びターゲットに追加このプロセスのバリエーションは、標的抗原の広い範囲に対する抗体試薬を単離するために広く使用されてきたが、通常は正の結合ファージの割合を増加させるために数回繰り返され、それらは一般的に精製された標的抗原24,25,26を大量に必要とし、本プロセスは、ターゲット抗原の微量必要一方、 図27は 、ここで説明するプロトコルは、精製およびパンを必要とせずに非常に低い濃度で存在している選択的に結合する標的抗原は、に対して直接行うことができる試薬を単離することができる複雑な組織サンプル中に存在する抗原。確認されるように徹底的なネガティブパニングプロトコルの使用AFMにより正の抗原に対する単離されたクローンを選択的に精製または濃縮なくても標的に結合する必要があることを保証します。Kasturiranganら（2003）は、ターゲット5ナノグラム濃度を用いてオリゴマーβ-アミロイドに対して反応性の抗体を単離するために類似の負及び正のバイオパニングプロセスを行った。ここでは、選択的に結合する疾患特異的タンパク質がヒト組織サンプルから直接改変試薬の生成を有効にするには、このプロセスに展開します。今後の研究では、我々はさらにだけでなく、ここで分離された試薬の診断価値を調査するだけでなく、ALSの治療のためにそれらの治療の関連性を評価していきます。
全体として、本発明の新規なAFMベースのバイオパニング技術は、タンパク質精製または修飾を必要とせずに、任意の生物学的材料の任意の疾患特異的タンパク質変異体の単離に適用可能であるべきである場合でも、標的抗原concentratioナノは極めて低い。
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R21AG042066：この研究は、NIHからの助成金によってサポートされていました。私たちは、画面キャプチャのビデオを作成する際の彼の貢献のためにフィリップ·シュルツに感謝したいと思います。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
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