Summary
Мы опишем протокол для мониторинга динамики Ca 2+ в аксонов фоторецепторов колбочек, используя препарат ломтик экс-естественных условиях сетчатки мыши. Этот протокол позволяет комплексные исследования конус Са 2+ сигналов в качестве важного млекопитающих модельной системы, мышь.
Abstract
Фоторецепторов сетчатки конуса (конусов) служат дневного видения и основу цвета дискриминации. Они подвергаются дегенерации, часто приводит к слепоте во многих заболеваний сетчатки. Кальций (Са 2+), ключевой вторичный мессенджер в передаче сигналов фоторецепторов и метаболизма, было предложено быть косвенно связаны с дегенерацией фоторецепторов в различных моделях на животных. Систематически изучая эти аспекты конуса физиологии и патофизиологии была затруднена из-за трудности электрически записи с этих маленьких клеток, в частности, в мыши, где сетчатка доминируют стержневых фоторецепторов. Чтобы обойти эту проблему, мы установили Ca 2+ протокол изображения двухфотонный помощью мыши трансгенной линии, которая выражает генетически закодированного Са 2+ биосенсора TN-XL исключительно в конусах и может быть гибридных моделей с мыши для дегенерации фоторецептора. Протокол, описанный здесь, включает подготовку вертикальных секций (R20; ломтики ") на сетчатке мышей и оптических изображений легких стимулирования, вызвали изменения в конус Са 2+ уровня. Протокол также позволяет "в-ломтик измерения" абсолютных концентраций Са 2+; как запись может следовать калибровки. Этот протокол позволяет исследования в функциональных свойствах конуса и, как ожидается, внести свой вклад в понимание конуса Са 2+ сигналов, а также потенциального участия Са 2+ в фоторецепторов смерти и дегенерации сетчатки.
Introduction
Видение начинается с активации светло-индуцированной фототрансдукции каскада в фоторецепторов сетчатки. Род фоторецепторы позволяют зрение на низких уровнях освещенности, в то время как конус фоторецепторов посредником цвета и высоким разрешением дневного видения. Многие фоторецепторов-специфических генов подвержены мутации, которые приводят к дегенерации этих клеток. Количество молекулярных маркеров, связанных с потерей фоторецепторов были идентифицированы 1, но до сих пор подробные молекулярные механизмы и последовательность событий, остаются неясными. Измененные Са 2+ гомеостаз предположил, чтобы быть триггером фоторецепторов гибели клеток, гипотеза поддерживается регуляцию активности Са 2+ -зависимых протеаз калпаина типа в процессе дегенерации 2,3. Тем не менее, на сегодняшний день, эта гипотеза не подкреплены физиологических измерений Ca 2+. Несоответствия в нескольких исследованиях о влиянии Ca 2+ антагонистов в рекишечные заболевания более осложняется участие Са 2+ в гибели клеток 4-6, призывая методов оценки непосредственно Са 2+ в млекопитающих фоторецепторов колбочек.
Ранее большинство электрических записи и исследования изображений Ca 2+ были проведены в амфибий и рептилий моделей из-за легкого доступа к конусов 7-9. Тем не менее, млекопитающих фоторецепторов физиология может отличаться от не-млекопитающих 10 и особенно в контексте человеческого наследственного дегенерации сетчатки, лучшее понимание млекопитающих фоторецепторов физиологии ключом к развитию инновационных методов лечения. Многие модели мыши, имитирующие заболеваний сетчатки человека имеются, но мало известно о Ca 2+ динамики в конусах мыши 11. Электрические методы не подходят для высокой пропускной записей из конусов, в частности, не у мышей, где прутки (~ 97%) значительно больше, чем конусы (~ 3%) 12 2+ токов, но не на абсолютных внутриклеточной концентрации Са 2+. Следовательно, несмотря на более низкую временным разрешением, изображения является методом выбора при решении вопросов о конусных Са 2+ динамики. Ключевой вопрос с изображениями, как выборочно пометить конусы с флуоресцентным Ca 2+ индикатор красителя. Правильное компартментализация и сотовый специфика трудно достичь, "основная загрузка" синтетический Са 2+ индикатор красителей в тканях. Как следствие, помеченных конусов, стержней 13,14 и Müller глиальные клетки не могут быть надежно отличается. Кроме того, синтетические красители, как правило, утечка из клеток, предотвращая длительные записи в соответствии условий. Кроме того, синтетические загрузки Ca 2+ показатели по своей форме АМ-эфира является проблематичным, поскольку он требует деtergents (например, ДМСО) и генерирует формальдегид 15. Для абсолютных измерений Са 2 +, логометрических показатели являются обязательными. Тем не менее, лучшими в настоящее время синтетические пропорциональный показатель Fura-2 требуется возбуждающего света в диапазоне от 700 до 760 нм (для двухфотонном возбуждении), который, в зависимости от его интенсивности, могут сами по себе стимулировать конусы, и, таким образом, препятствовать исследования конус Са 2+ динамика в физиологических условиях освещения.
В отличие от синтетических красителей, генетически закодированные Са 2+ показатели могут быть выражены в типа селективного образом клеток. Они не вытекать из клеток, и, следовательно, если избегать отбеливание, длительные и надежные измерения логометрических возможны. Типа селективный сотовый выражение Ca 2+ биосенсоров, в сочетании с двумя-фотонной микроскопии, представляет собой мощный инструмент для оценки и изучения внутриклеточной Са 2+ под значительной степени физиологических условиях 13,16,17 2+ динамика в трансгенных Ca 2+ биосенсора мыши линии (HR2.1: TN-XL), которая выражает лада на основе Ca 2+ биосенсора TN-XL 18 выборочно в конусах, в человеческом красный опсина промоутер HR2.1 19. Чтобы получить доступ к конусные клеммы, был использован препарат экс-естественных ломтик 20. Протокол был уже успешно используется в трех исследованиях на функции конуса у здоровых мышей 10,21,22. Кроме того, протокол позволяет изучать конуса Са 2+ сигналов в конкретных генетических заболеваний, например, путем скрещивания модели мыши для наследственной дегенерации сетчатки с HR2.1: мышей ТН-XL.
Protocol
Все процедуры на животных были проведены придерживаясь принципов и законов для защиты животных, определенных Федеральным правительством Германии и утвержденных институциональной защиты животных комитета в Университете Тюбингена.
1. Животные модели
- HR2.1: TN-XL Са 2+ биосенсора мыши
- Используйте трансгенного HR2.1: TN-XL мыши линии выражения Ca 2+ биосенсора TN-XL выборочно конуса фоторецепторов 10. Используйте 3 - 6 недель мышей обоего пола поднятой со стандартным 12 часов день / ночь ритм.
2. Препарирование сетчатки
- Физиологический раствор
- Подготовьте свежемолотый 2 л внеклеточный раствор, содержащий 125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,25 мМ NaH 2 PO 4, 26 мМ NaHCO 3, 0,5 мМ L-глутамина и 20 мМ (+) глюкозы. Смешайте все ингредиенты до полного растворения.
- "Пузырь" внеклеточный растворс carboxygen (95% O 2, 5% СО 2) в течение 5 - 10 мин. Добавить CaCl 2 до концентрации 2 мМ.
- После барботирования внеклеточный раствор, измерить его рН. РН должно быть 7,4, в противном случае вполне вероятно, что были допущены ошибки в процессе приготовления раствора. Держите постоянную температуру кип скорость и решение всей эксперимента, чтобы обеспечить постоянное значение рН.
- Отделите акции в 2 колбы, по одному для сетчатки рассечение и один для установки записи (перфузии).
- Энуклеации глаза и изоляция сетчатки (5 - 10 мин)
- Поддерживать тусклый красный освещение в рабочей зоне для энуклеации. Используйте светодиоды с длиной волны максимума излучения 650 нм (или больше), чтобы избежать отбеливания конусов во время вскрытия.
- Темно-адаптировать мышь в течение 2 ч, поставив свою клетку в хорошо проветриваемом, защищенном от света, окна для того, чтобы шишки были полностью информированы в момент записи.
- Анестезировать мышь под laboratoRy капот с изофлуран (5%) с использованием испарителя и газонепроницаемый контейнер, который содержит стандартный клетку мыши. Внимательно следуйте указания производителя при обращении с испарителя. Используйте перчатки и маску, чтобы уменьшить воздействие аллергенов.
- Используйте бинокулярный микроскоп с 10 - 40-кратном увеличении для вскрытия.
- Жертвоприношение анестезированной мышь путем обезглавливания.
- Для ориентации, отмечают в верхней части каждой глаз (= спинной) с водонепроницаемым пером. Следите ли с помощью левой или правой глаза.
- Снимите глаз тщательно, используя изогнутые ножницы путем разрезания зрительный нерв за глазное яблоко. Для вскрытия, передача глазного яблока в чашке Петри, содержащей недавно carboxygenated внеклеточный раствор. Для передачи глазное яблоко, держите его зрительного нерва пень.
- Пирс глаз в любой точке вдоль границы между роговицей и склерой (т.е., на зубчатый край) с резким инъекционной иглой.
- Держите евы в склеры с парой щипцов и аккуратно вставьте один ножницы лезвие в отверстие, сделанное в предыдущем шаге. Вырезать по зубчатый край, чтобы отделить переднюю часть глаза (роговицы, хрусталика, стекловидного тела) от задней части (наглазника). Сокращение окуляр радиально (в сторону диска зрительного нерва) в положении ручки отметки, чтобы указать положении лежа на спине на сетчатке.
Примечание: Подготовлено Таким образом, наглазники могут храниться в постоянно carboxygenated решения для последующего использования. - Поверните окуляр в чашке Петри, так что спинной сократить точки от себя. Захват склеры на левой и правой стороне наглазник с парой щипцов каждого вставив кончики щипцы между сетчатки и склеры.
- Снять сетчатки, осторожно переворачивая склеры часть наглазник. Наконец, вырезать зрительного нерва с помощью микро рассекает ножницы, чтобы освободить сетчатку от склеры.
Примечание: Это важный шаг. Избегайте повреждения сетчатки (например, потрогательно и сжимая ее щипцами). - Держите один из краев сетчатки с парой щипцов и аккуратно убрать мусор и стекловидное тело с поверхности сетчатки, используя вторую пару щипцов. При сетчатки поверхность чистая, использовать микро рассекает ножницы, чтобы сделать три дополнительных коротких и радиальные разрезы (примерно каждые 90 °). Эти сокращения позволяют тщательно сгладить сетчатки с фоторецепторов стороной вниз в чашке Петри (рис 1А).
- Подготовка фрагмент (10 - 15 мин)
- Заранее подготовить мембраны нитроцеллюлозы фильтр для сетчатки нарезки стекла и кавер-квитанции для монтажа ломтики и передачи их в записи камеры. Вырезать нитроцеллюлозный фильтр мембраны в приблизительно 10 х 5 мм размера прямоугольные куски с помощью ножниц. Вырезать покровные в приблизительно 10 х 5 мм размера прямоугольные куски, используя стекольщик.
- Медленно опускайте стекла слайд в внеклеточный раствор близок кткань. Осторожно потяните сетчатки на стекле со стороной ганглиозных клеток до захватывая его на самом краю, используя пару щипцов. Этот процесс снижает механические повреждения и складывание ткани.
- Выберите область сетчатки, которая связана с соответствующей научно-исследовательской вопрос (см также обсуждение). Помните, долго отсечения в шаге 2.2.9 отмечает спинной сетчатки половину (рис 1А). Сокращение прямоугольную, приблизительно 1 х 2 мм размера кусок из выбранной области сетчатки, используя изогнутый скальпель лезвием. Протрите излишки раствора вокруг ткани.
- Поместите мембрану фильтра в верхней части куска сетчатки так, что сторона ганглиозных клеток прилипает к мембране. Сразу же добавить каплю внеклеточной среды на мембрану, чтобы прочно прикрепить ткань с мембраной.
- Передача мембраной установлен ткани сетчатки к камере, содержащей нарезки свежего внеклеточный раствор.
- Вырезать сетчатки в вертикальных срезов 200 мкмТолщина (Фигура 1В) с использованием свежей лезвие бритвы, прикрепленный к тканевой измельчитель 23. Изменить лезвие для каждого сетчатки кусок.
Примечание: Блок лезвий бритвы должно быть идеально выровнены с поверхностью камеры нарезки нижней таким образом, чтобы вся мембрана разделяет одновременно, как обозначено "нажав" звук при резке - в противном случае лезвие может согнуть и повредить срез. - Клей одного мембраной установлен кусочек для стеклянной крышкой-скольжения с применением высокого вакуума смазку на мембране заканчивается только (Рис 1С). Держите поверхности стекла ниже сетчатки обезжиренными.
- Держите покровного монтажа ломтики покрытые капли внеклеточного раствора в удерживающей камере - замкнутый, защищенном от света контейнер, например, чашку Петри с крышкой, покрытой алюминиевой фольгой - в атмосфере carboxygen при комнатной температуре. Представьте carboxygen путем пропускания небольшой резервуар для воды, чтобы сохранить атмосферу в проведениикамера увлажняется; это предотвращает ломтики от высыхания.
- Разрешить ломтиками, чтобы отдохнуть в удерживающей камере в течение 10 - 15 мин перед их перемещением (по одному) к записи камеры. Ломтики можно поддерживать до 4-5 часов в удерживающей камере при комнатной температуре (~ 21 ° С).
3. Двухфотонное Ca 2+ изображений
- Двухфотонное микроскопии
- Используйте Movable Цель микроскоп (MOM) -типа двухфотонную микроскопа. Оба дизайн и изображений процедуры MOM были описаны ранее 24 подробнее см также 10,21,25 (для источников и компаний, таблица 1).
Примечание: Любой вертикально двухфотонную микроскоп, который выполняет следующие минимальные требования могут быть использованы: Он должен быть оснащен (а) импульсного лазера перестраиваемого до ~ 860 нм, (б) как минимум двух одновременно приобретенных флуоресценции каналов, (с ) фильтры для ECFP и флуоресценции цитрин (D)свет стимулятор (для возможных конструкций, см 24,26) и (е) программное обеспечение, которое позволяет записывать время истек последовательности изображений с частотой кадров, достаточной для решения Ca 2+ сигналы, представляющие интерес. - Начало системы визуализации двухфотонного, как указано производителем. Строго следовать рекомендациям лазерной безопасности Фонда. Начните лазер и настроить его на ~ 860 нм.
- Перевести кусочек от удерживающей камеры в камеру записи и немедленно начать перфузии с внеклеточной carboxygenated решения. Поддержание скорости потока перфузии 2 мл / мин и температуре 37 ° С в камере записи.
- Используйте 20X 0,95 NA погружением в воду цели. Если возможно, используйте ПЗС-камеры в сочетании с инфракрасной светодиодной ниже записи камеры, чтобы найти кусочек сетчатки (рис 2). В противном случае найдите кусочек, используя два-Фотон изображений (см 3.1.5).
- Переключение в режим визуализации двух фотонов, чтобы посмотреть выражение биосенсора. Включитьдва канала обнаружения для флуоресцентной визуализации ECFP и цитрина.
- Используйте программное обеспечение получения изображений, который управляет двухфотонную микроскоп для сканирования и выберите строку конуса терминалов для записи (рис 3а). Набор получения изображения 128 х 16 пикселя изображений (31,25 Гц) или аналогичной конфигурации. Ограничить область сканирования, чтобы конус терминалов, чтобы избежать отбеливания фотопигментов в наружных сегментах.
Примечание: Для TN-XL датчика кальция (τ = ~ 0,6 сек для связывания Са 2+, τ = ~ 0,2 сек для Ca 2+ развязывание, см 16) с минимальной скоростью кадров ~ 8 Гц рекомендуется.
- Используйте Movable Цель микроскоп (MOM) -типа двухфотонную микроскопа. Оба дизайн и изображений процедуры MOM были описаны ранее 24 подробнее см также 10,21,25 (для источников и компаний, таблица 1).
- Свет стимуляция и запись
- Используйте суб-этап полного светового поля стимулятор, как описано в другом месте, чтобы 10,21,26 выполните следующие действия.
Примечание: простое решение для полного светового поля стимулятора является использование двух полосовых-отфильтрованные светодиодов (например, "синий": 360 ВР 12, "зеленый": 578 ВР 10)которые соответствуют длины волны чувствительности мыши конусов, но в то же время не перекрываются с фильтров, используемых для регистрации флуоресценции (ср. 3.2.4). Свет от светодиодов фокусируется конденсатора через нижнюю часть записи камеры (рисунок 2). Для получения подробной информации о данной конструкции стимулятор, его калибровки интенсивности света используются и вызванных ставки фото-изомеризации конуса, см 10,21,26. - Включите лазер и позволит шишки, чтобы приспособиться к лазерной сканирующей и стимулом фонового света (20 - 30 сек, см также потенциальные ловушки), прежде чем представлять световых раздражителей (см 3.2.3) или применения фармакологических средств.
- Начать презентацию произвольных раздражители (например, вспышки света, как показано на рисунке 3B, C). В случае стимулятора, описанной в пункте 3.2.1, генерировать стимулы посредством модуляции интенсивности двух светодиодов с течением времени с использованием микропроцессорной плате под контролем специального программного обеспечения (дляПодробнее см 10,21,26).
- Начало записи двух каналов флуоресценции (например, на 483 нм для "голубой" лобзики доноров ECFP и при 535 нм для «желтой» FRET-акцептора;. Для спецификации см таблицу 1) одновременно с использованием соответствующего программного обеспечения получения изображений (см также 3.1 0,6). Например, в случае вспышки света (Фиг.3В, С), запись по меньшей мере, 8 - 10 стимулирующих презентаций (испытаний).
- Используйте суб-этап полного светового поля стимулятор, как описано в другом месте, чтобы 10,21,26 выполните следующие действия.
- Калибровка "В-среза" Ca 2+
- Запись Са 2+ сигналы в конусных терминалов (как описано в 3.1.6 и 3.2.4) и извлекать базового уровня Ca 2+ в наборе конусов (как описано в 3.4).
- Переключатель в положение "свободного Ca 2+" внеклеточной среде с 5 мкМ иономицина (растворенного в ДМСО) и 10 мМ EGTA (или, альтернативно, BAPTA) добавили. Запись конус терминалы снова каждые 5 мин, чтобы определить минимальное соотношение флуоресценции (R мин), <EM> т.е. соотношение в (ближайшем) отсутствие внутриклеточного Ca 2+. Это может занять от 15 - 30 мин.
Примечание: Система перфузии требуется, что позволяет переключение между различными резервуарами. - Переход к внеклеточной среде с 5 мкМ иономицина (растворенного в ДМСО) и 2,5 мМ Ca 2+. После инкубационного периода от 5 мин, запись шишки снова каждые 5 мин, чтобы измерить максимальную соотношение флуоресценции (R макс), то есть соотношение в присутствии насыщающих концентраций внутриклеточного Ca 2+. После Ionomycin приложение, это может занять от 3 - 15 мин для отношения Ca 2+, чтобы стать стабильным.
Примечание: Воздействие ломтики с высокой Са 2+ и Ionomycin в течение длительного периода в конечном итоге может привести к повреждению клеток. Включить только клетки в анализе, которые сохраняют свою нормальную морфологию. Концентрации (т.е., ЭДТА,, иономицином), возможно, потребуется адаптировать. Для более подробной информации о калибровке Ca 2+Протокол см 13,17.
- Анализ данных
Примечание: Используйте для обработки изображений и анализа данных пакет программного обеспечения, совместимого с соответствующим программным обеспечением микроскопа и способной работать скрипты анализа пользовательских.- Загрузите файл данных изображений и рисовать регионы интереса (трансформирования) вокруг каждого конуса терминала (Рисунок 3А). Для каждого кадра, средней интенсивности флуоресценции в пределах ROI и вычитать фоновой флуоресценции, перед вычислением отношения (R) между FRET-акцептора (цитрин) и доноров (ECFP) флуоресценции (R = F A / F D; Рисунок 3B, C). Это отношение, как правило, используется в качестве прокси-сервера для относительной внутриклеточной концентрации Ca 2+, но после калибровки (см 3.3), а также абсолютные концентрации можно оценить (см 3.4.3).
Примечание: плодоножки может быть признано их расположения в наружной плексиформной слоя и их морфология (несколько уплощенная "капли" меньше чем конусаsomata, расположенный на конце конуса аксона). - Средние испытания раздражитель (рис 4А). Экстракт параметры отклика от усредненных следов (фиг.4В), таких как Са 2+ базовом уровне (R) основания до световой стимуляции, пиковой амплитуды (R AMP) и площади под кривой (R A) в качестве мер по размеру отклика. Кроме того, экстракт кинетики реагирования из усредненных следов, таких, как повышение отклика (т нарастания) и времени затухания (т затухания) (= соответствующих интервалов времени между 20% и 80% R усилителя, см иллюстрацию на рис 4B). Для более подробной информации о том, как определить эти параметры, см 10.
- Рассчитать оценку абсолютного конуса Са 2+ концентрации на основании измерений из шагов 3.3.1-3.3.3. Используйте отношения для минимального и максимального Ca 2+ концентрации, R мин и макс R, соответственно, донор флуоресценции в Са 2+ D, Са переплете) и -unbound (F D, Са-бесплатно) состояние, а также в естественных условиях константа диссоциации (K d = 0,77 см 16) для TN-XL с следующее Уравнение (аналог 27):
- Загрузите файл данных изображений и рисовать регионы интереса (трансформирования) вокруг каждого конуса терминала (Рисунок 3А). Для каждого кадра, средней интенсивности флуоресценции в пределах ROI и вычитать фоновой флуоресценции, перед вычислением отношения (R) между FRET-акцептора (цитрин) и доноров (ECFP) флуоресценции (R = F A / F D; Рисунок 3B, C). Это отношение, как правило, используется в качестве прокси-сервера для относительной внутриклеточной концентрации Ca 2+, но после калибровки (см 3.3), а также абсолютные концентрации можно оценить (см 3.4.3).
Representative Results
Объединив вертикальные ломтики (рисунок 1), приготовленные из HR2.1: TN-XL мыши сетчатки с двух фотонов томографии (рис 2), мы были в состоянии выполнить логометрических измерения светового стимула, вызвали Ca 2+ сигналов в аксонов фоторецепторов конуса , Этот подход представляет собой значительное улучшение в доступе и визуализации мыши конусов над уже существующими методами оптических изображений с синтетическими Са 2+ показателей. Например, конус-специфическая экспрессия генетически закодированного логометрической Ca 2+ биосенсора TN-XL значительно облегчил идентификацию конуса аксонов (см трансформирования на фиг.3А). Таким образом, наш протокол устраняет риск записи сигналов неясного происхождения, как, например, "смешанные" сигналы с обоих вкладов от конуса и стержень аксонов.
Наш подход позволяет решения одного пробные ответов на уровне INDIVIдвойной конус аксона. Свет-вызывала экструзии Са 2+ из конуса терминала отмечен увеличением и уменьшением донора и акцептора флуоресценции, соответственно (фиг.3В). Снижение коэффициента флуоресценции (R) соответствует экструзии Са 2+ из конуса терминала (рис 3C), вызванного светоиндуцированного гиперполяризации конуса и последующего закрытия напряжения закрытого Са2 + -каналов. Поскольку несколько конуса аксонов может контролироваться одновременно (3А), сбора данных является очень эффективным и сотни ответов конуса Са 2+ могут быть собраны в одном эксперименте. По оценке этих ответов количественно (фиг.4), конус Са 2+ сигналы могут быть сравнены и оценены в диапазоне условий (см обсуждение).
Это часто бывает достаточно, чтобы использовать соотношение между FRET-акцептора (цитрин) и -donor (ECFP) флуоресценции(F / F D; подробнее см 3.4) в качестве относительной меры внутриклеточного Са 2+ уровня. Тем не менее, всякий раз, когда это необходимо, соотношение может быть откалиброван для получения абсолютных внутриклеточные концентрации Ca 2+ ([Ca 2+]) (рисунок 5). В фоновой подсветки, используемой в этом протоколе (подробнее см 10 и Рисунок 3 легенда), калибровка дали оценку абсолютной отдыхает [Ca 2+] в "дикого типа" HR2.1: TN-XL мыши конус терминалы 243 ± 159 нМ (среднее ± стандартное отклонение), который находится в пределах диапазона, указанного на мышах, описанных в литературе 11.
Рисунок 1. Подготовка вертикальных сетчатки ломтиками. () Изолированные и плоскими сетчатки готовы для нарезки. (Б) Прямоугольный кусок сетчатки (си ее красный квадрат в A) установлен на фильтровальной бумаге мембраны (темно-серый), после нарезки. (С) Вид сверху мембраны монтажа сетчатки срез закрепленного на покровного стекла с использованием смазки. (D) Схематическое изображение части сетчатки срез (см красный флажок в C). Фоторецепторы конуса указаны в зеленый. В, брюшной; D, спинной; N, носовые; Т, временная; ОС, наружный сегмент; ОНЛ, наружный ядерный слой; OPL, внешний сетчатый слой; INL, внутренний ядерный слой; IPL, внутренний слой сетчатого; ВКТ, ганглиозных клеток слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Двухфотонное изображений сетчатки ломтиками: Иллюстрация конфигурации записи Топ:. Вода погружения объектив фокусировки будетутра лазера сканирования (красный вниз стрелка) в сетчатку, и сбора испускаемого флуоресценции (стрелки вверх). Объектив также собирает передается инфракрасный свет от светодиода, установленного освещения ниже конденсатора при визуализации срез с помощью ПЗС-камеры Центр:.. Сетчатке ломтик установлен в записи камеры и перфузии внеклеточный раствор Bottom: Линза фокусировки света от светодиодов стимуляции (и инфракрасный светодиод для изображений ПЗС-камеры) через прозрачное дно камеры записи в ткани сетчатки. ИК-светодиод, ИК-светодиод; ПЗС, прибор с зарядовой связью; ВР, полосовой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Свет-Вызываниеответы D Ca 2+ в аксонов терминалов мыши конуса фоторецепторов. () Слева: Записи сосредоточены на синаптических терминалов (красная коробка) колбочек (зеленый) в сетчатке ломтиками право:. Пример для записанной области с 7 отдельных терминалов. Флуоресценции был записан с помощью двух каналов:. Один для лада-акцепторной цитрин (вверх; 535 BP 50) и один для лада-доноров ECFP (внизу; 480 BP 32) (Б) светло вызвали изменения в цитрин (F) и ECFP флуоресценции (F D), записанные в одной ROI. ответы (C) Ca 2+ (как отношение F A / F D) конусной терминала серии 1 сек ярких световых вспышек в 5-секундными интервалами. ROI, область интересов; ВР, полосовой фильтр; Ж, интенсивность флуоресценции; Au, условные единицы; FRET, Ферстер резонанс переноса энергии; ECFP, усиливается голубой белок флуоресценции. Интенсивность стимула (как рСкорость Хото-изомеризации в 10 3 · Р · с -1 за конуса):. 13,0 и 12,8 для м- и S-опсинов, соответственно, добавляя на уровне фона (= светодиоды выключены, лазерное возбуждение сканирования) ~ 10 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Примерная количественный анализ светло-вызванных конуса Са 2+ ответов () светло вызвало Са 2+ ответы (как ΔR) из одного терминала конуса (отдельные исследования: серые следы, п = 16; средний:. Черный след ) (B) Параметры определяются для среднего Ca 2+ ответ:. Опираясь Ca 2+ уровня (R базу), представляющий базовую перед световой стимуляции, размер ответа в АРEA-под-кривой (R A) и амплитудой (R усилителя), кинетики реакции начала (т подъеме, промежуток времени от 20% до 80% от R усилителя) и смещения (т распада, промежуток времени от 80% 20% R усилителя). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Оценка абсолютной концентрации Ca 2+. Отдых Ca 2+ концентрации ([Ca 2+], как отношение F A / F D), записанного в аксонов 8 конуса в мыши TN-XL (кругов, со средним ± SD) для различных внеклеточных решения: два раза в стандартном внеклеточной среде (Ctrl 1 и 2), а затем с минимальным («нулевой») [Ca 2+] (10 мМ EGTA) апd с высокой [Ca 2+] (2,5 мм), последние два условия в присутствии 5 мкМ иономицином, чтобы уравновесить внеклеточный и внутриклеточный Са 2+. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Предварительно существующие протоколы, использующие электрофизиологические записи одноклеточных или Ca 2+ изображений с синтетическими люминесцентных индикаторов бороться, чтобы записать Ca 2+ динамику мыши конуса фоторецепторов по ряду технических причин (см введение). Протокол, описанный здесь, позволяет измерять Са 2 + сигналов и даже абсолютных Са 2+ уровня в отдельных, определенных мыши конуса терминалов в эффективной и относительно простой способ.
Этот протокол уже успешно используется в трех исследованиях, касающихся различных аспектов функции конуса в сетчатке здорового мыши. В первом исследовании 10, HR2.1: мышь TN-XL характеризуется использованием иммуногистохимии, ERG записи, двухфотонную Ca 2+ изображений и фармакологию, показывая, что конус-специфическая экспрессия Са 2+ биосенсора не мешает конус анатомия и функция. Во втором исследовании 21, хроматическаяи ахроматические свойства отклика мыши конусов были намечены по сетчатке, демонстрируя поразительные различия в функции конуса между «зеленой» опсина доминируют спинного и "голубой" опсина доминируют вентральной части сетчатки мыши. Эти региональные различия в свойствах конуса соответствует распределение дифференциального контраста в естественной среде (т.е., небо против земли), предполагая, что различные спектральные типы мыши конусов обеспечивают (ближайшем) оптимальной выборки ахроматических контрастов и, таким образом, может предложить эволюционное преимущество. В третьем исследовании 22 обратной обратной связи, который конуса аксонов получают от горизонтальных клеток исследовали. Как и все предлагаемые механизмы обратной связи по горизонтали ячейки действуют на напряжения закрытого Ca 2+ каналов в конусе аксонов 28, конус терминал Са 2+ может служить в качестве прокси для горизонтальных клеток в конусе взаимодействий. Исследование Kemmler и сотрудники 22 опорымнение, что горизонтальные клетки используют сложную систему обратной связи, содержащую несколько механизмов для управления фоторецепторов выпуск глутамата.
Эти исследования показывают универсальность описанного протокола и показать, что она может быть приспособлена к широкому диапазону вопросов относительно функции конус и синаптические цепи. Кроме того, протокол дает возможность изучать местное Ca 2+ сигналов в разных отсеках конуса, в направлении лучшего понимания конуса физиологии. Такое знание важно понять патофизиологические процессы в вырождающихся конусов, в конечном счете, позволит рационального развития потенциальных терапевтических подходов, в частности, для дегенеративных заболеваний, влияющих на конусы.
В HR2.1: TN-XL мыши линии, Ca 2+ биосенсора экспрессируется по всей конуса, за исключением наружного сегмента. Это дает возможность для прямого и логометрической оценки Са 2+ динамическийс отделениями в разных конуса. С изменениями в Са 2+ токи в наружном сегменте отражаются в терминалах через мембранный потенциал и в результате активации напряжения закрытого Са 2+ каналов, процессы в космическом сегменте можно наблюдать косвенно.
Потенциальные ловушки:
Рассечение сетчатки является важным шагом: В мыши, сетчатка отделяется от окуляра, как правило, между наружных сегментов фоторецепторов и пигментного эпителия. Таким образом, светочувствительный наружных сегментов фоторецепторов изолированной сетчатки подвергаются и чрезвычайно чувствительны к механическим повреждениям. Большое внимание должно быть принято, чтобы не повредить, касаясь фоторецепторов сторону с инструментами или путем перемещения ткани боком на клейкой поверхности (например, мембрану фильтра).
Высококачественные сетчатки ломтики могут быть признаны под микроскопом их чистой режущей поверхности ис помощью хорошо организованной фоторецепторов слоя с четко определенными наружных сегментов. Функциональная оценка качества среза может быть сделано быстро мигающий яркий свет стимулы и определения процентного отзывчивых конусов (например, в поле зрения с 10 - 20 конусов). Здесь, качество реакция должна быть оценена путем расчета отношения сигнал-шум (S / N) (амплитуда базового шума до световой раздражитель против амплитуды световой ответ); S / N 2 - 3 следует рассматривать как минимальный порог. Как правило, отбросить кусочки с менее чем 50%, реагирующих конусов. Также ломтики с шишками, которые отображают чрезмерное поведение спонтанной пики (рис 4 в 10) следует выбросить.
Ломтики в записи камеры, которые отвечают вышеупомянутым анатомические и функциональные критерии показывают последовательные ответы в течение 1 - 2 ч (для подробной информации о последовательности реакции, см 10). Потому что ломтики выжить чНаши в удерживающей камере, успешный эксперимент может длиться до 6 часов. Стоит отметить, что существуют некоторые ограничения в отношении к изучению давно, начиная пространственных взаимодействий между конусами и горизонтальными клетками, а нарезка неизбежно разрывает боковые связи в сетчатке глаза сетей. Тем не менее, увеличение толщины сетчатки ломтиками до 300 мкм улучшает эту проблему 22.
Использование вертикальных срезов сетчатки позволяет избежать сканирования светочувствительным конуса наружных сегментов с помощью лазера возбуждения и, таким образом, в значительной степени предотвращает обесцвечивание Opsin (для широкого обсуждения см 10,21). Тем не менее, записанные Са 2+ сигналов зависит не только от световых сигналов, но также получить затронуты фоновой подсветкой компонента, генерируемого лазером возбуждения сканирования. В самом деле, эффективна подсветка в таких двухфотонных экспериментов изображений представляет собой сочетание рассеянного лазерного света, флуоресцентного света, испускаемого записанного CEзаполняет, и любой индикатор стимулом фон компонента. Таким образом, конусы должны иметь возможность адаптировать по крайней мере 20 - 30 с до лазерного сканирования (с фоновой составляющей светового раздражителя включен) перед записью.
Преимущества и применение:
В то время как некоторые приложения для этого конуса Са 2+ -imaging протокола были описаны выше 10,21,22, другие приложения могут быть предусмотрены: Фармакологические исследования в сочетании с конусом Са 2+ изображений может подтвердить Ca 2+ сигнальных путей в конусах и может быть используется для проверки эффективности и потенции наркотиков, предназначенных для различных игроков в Ca 2+ -signaling 10. Тем не менее, ключевым приложение может быть для изучения заболеваний, влияющих на функцию конуса. Многие модели сетчатки дегенерация мыши, имитирующие человеческие болезни имеются. Например, потеря колбочек 1 (CPFL 1) мышь первичной дегенерации конус модель страданиеот мутации Pde6c 29. С другой стороны, стержень дегенерации 1 (ий 1) мыши страдает от мутации Pde6b. В то время как это вызывает основной стержень дегенерацию фоторецепторов 30 раз го 1 поражение стержень завершены, вторичные наборы конус вырождение 1. Скрещивание этих животных с HR2.1: TN-XL линия позволит изучения и сравнения Ca 2+ динамику первичной и вторичной дегенерации конуса и, вероятно, получить ценную информацию о роли Са 2+ во конус гибели клеток. Кроме того, фармакологически индуцированной конуса дегенерации - например, с использованием селективных ингибиторов PDE6 - может служить для идентификации вниз по течению механизмы конус вырождения 10,29,31.
Таким образом, протокол, описанный здесь, позволяет измерять Ca 2+ в субклеточных отсеков мыши конуса фоторецепторов и представляет большие возможности для выявления конуса физиологию в широком диапазонефизиологических и патофизиологических условиях. Кроме того, этот протокол может быть использован для скрининга фармакологических агентов, предназначенных для мешать конус Са 2+ -signaling и тем самым помочь в создании новых методов лечения для конусных заболеваний.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |
References
- Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
- Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
- Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
- Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
- Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
- Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
- Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
- Krizaj, D.
Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012). - Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
- Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008). - Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
- Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
- Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
- Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
- Connaughton, V. P.
Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003). - Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
- Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
- Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
- Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
- Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
- Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
- Thoreson, W. B., Mangel, S. C.
Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012). - Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
- Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488 (2013).
- Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495 (2010).