Évaluation fonctionnelle et morphologique de membrane innervation par phrénique motoneurones
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
La sclérose latérale amyotrophique (ALS) est une maladie débilitante des neurones moteurs associés à la perte des deux neurones moteurs supérieurs et inférieurs et en conséquence une paralysie musculaire. Lors du diagnostic, la survie des patients est en moyenne de seulement 2-5 ans 1. Phrénique motoneurone (PhMN) la perte est une composante essentielle de la pathogenèse de la SLA. Les patients finissent par mourir à cause de la perte de PhMN innervation du diaphragme, le muscle principal de l'inspiration 2,3. Traumatisme de la moelle épinière (SCI) est également un sérieux problème avec des difficultés respiratoires associés. Environ 12 000 nouveaux cas de SCI se produisent chaque année 4 en raison de dommages traumatiques de la moelle épinière. Malgré l'hétérogénéité de la maladie par rapport à l'emplacement, le type et la gravité, la majorité des cas SCI implique un traumatisme à la moelle épinière cervicale, ce qui se traduit souvent par une insuffisance respiratoire invalidante et persistante. En plus de la SLA et SCI, autre système nerveux central (SNC) peut être associée wdysfonctionnement respiratoire diaphragmatique vec 5,6.
Le nerf phrénique est un nerf moteur efférent qui innerve l'hémi-diaphragme ipsilatéral et qui provient de corps cellulaires PhMN situés dans les niveaux C3-C5 de la moelle épinière cervicale homolatérale. PhMN sortie est contrôlé par décroissant entrée bulbospinal du tronc cérébral dans une zone connue sous le nom du groupe rostrale ventrale respiratoire (rVRG) 7. Le circuit rVRG-PhMN diaphragme est au cœur du contrôle de la respiration inspiratoire, ainsi que d'autres comportements à membrane non-ventilatoires. Diverses blessures traumatiques et des troubles neurodégénératifs qui affectent ces circuits peuvent conduire à une baisse profonde de la fonction respiratoire et la qualité de vie des patients. Décroissant entrée PhMNs de la survie rVRG, PhMN, l'intégrité du nerf phrénique et l'innervation correcte à la jonction neuromusculaire diaphragme (NMJ) sont tous nécessaires pour le fonctionnement de la membrane normale. Il est donc important d'utiliser des techniques quipeut évaluer quantitativement ce circuit in vivo dans des modèles de rongeurs de la SLA, SCI et d'autres maladies du SNC.
Avec ce protocole, l'objectif est de décrire les outils expérimentaux pour évaluer PhMN innervation du diaphragme à la fois au niveau électrophysiologiques et morphologiques. Composé potentiels d'action musculaire (CMAP) sont enregistrées en stimulant tous les axones moteur efférent de neurones d'un nerf moteur donnée, puis analyser la réponse de dépolarisation élicite des myofibres cibles. Cette technique peut être utilisée in vivo chez des rats et des souris anesthésiées à quantifier innervation fonctionnelle de l'hémi-diaphragme par PhMNs 8. En raison du fait que CMAP représentent enregistrement simultané de tous (ou au moins beaucoup de / la plupart) myofibres de l'ensemble de l'hémi-diaphragme, il est utile d'examiner également les phénotypes des axones et myofibres automobiles individuels au NMJ de diaphragme afin de suivre la maladie – et des changements morphologiques thérapie pertinentes telles que partielle et complete dénervation, germination régénérative et réinnervation. Ceci peut être accompli via l'ensemble du support immunohistochimie (IHC) de la membrane, suivie d'une évaluation morphologique de NMJs individuels à travers le muscle 9. Combinant CMAP et l'analyse NMJ offre une approche puissante pour étudier quantitativement innervation diaphragmatique dans des modèles rongeurs de la maladie SNC et du SNP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme la fonction respiratoire est compromise à la fois SCI traumatique et la SLA, le développement de thérapies qui ciblent spécifiquement la respiration et l'innervation diaphragme sont cliniquement significatives 5,6. Afin d'étudier globalement la fonction respiratoire, une méthode d'approche combinée devrait être utilisé. CMAP mesurent le degré d'innervation fonctionnelle de la membrane par le biais de la stimulation du nerf phrénique externe, mais la commande respiratoire bulbo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
