Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
Leberentzündung als Reaktion auf eine Verletzung ist ein hochdynamischer Prozess, der die Infiltration von verschiedenen Subtypen von Leukozyten einschließlich Monozyten, Neutrophile, T-Zellen-Untergruppen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und die NKT-Zellen. Intravitalmikroskopie an der Leber zur Überwachung Immunzellmigration ist besonders herausfordernd aufgrund der hohen Anforderungen an die Probenvorbereitung und die Fixierung, die optische Auflösung und die langfristige Überleben des Tieres. Dennoch könnte die Dynamik von entzündlichen Prozessen sowie zellulären Interaktionsstudien kritische Informationen, um die Initiation, Progression und Regression von entzündlichen Lebererkrankungen besser zu verstehen ist. Daher wurde eine hochempfindliche und zuverlässiges Verfahren eingerichtet, um die Migration und Zell-Zell-Wechselwirkungen von verschiedenen Immunzellen in Mausleber über lange Zeiträume (ca. 6 h), die durch intravitale Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) in Kombination mit Intensiv studieren Überwachung.
ent "> enthält die vorgesehenen Verfahren eine schonende Zubereitung und stabile Fixierung der Leber mit minimaler Störung des Organs, langfristig intravital Bildgebung mit Mehrfarben-Multiphotonen-Mikroskopie praktisch ohne Bleichen oder phototoxische Effekte über einen Zeitraum von bis zu 6 Stunden, so dass Tracking- spezifischer Leukozytenuntergruppen und stabile Bilderzeugungsbedingungen durch umfangreiche Überwachung Maus Vitalparameter und Stabilisierung der Zirkulation, Temperatur und Gasaustausch.Lymphozytenmigration auf Leberentzündung untersuchen CXCR6.gfp Knock-in-Mäusen wurden intravitalen Bildgebung der Leber unter Ausgangsbedingungen und nach akuter und chronischer Leberschädigung durch intraperitoneale Injektion (en) von Kohlenstofftetrachlorid (CCl 4) verursacht wird, ausgesetzt.
CXCR6 ein Chemokin-Rezeptor auf Lymphozyten exprimiert, hauptsächlich auf Natural Killer T (NKT) -, natürliche Killer (NK) – und Untergruppen von T-Lymphozyten, wie CD4-T-Zellen, sondern auch Schleimhaut associATED invariant (MAIT) T-Zellen ein. Im Anschluss an die Migrationsmuster und die Positionierung der CXCR6.gfp + Immunzellen erlaubt einen detaillierten Einblick in ihr verändertes Verhalten auf Leberschäden und damit ihre mögliche Beteiligung im Fortschreiten der Krankheit.
Introduction
Die Visualisierung von Zellen und Zellfunktionen in ganzer Organe oder ganze Organismen von großem Interesse für mehr als 50 Jahren, darunter nahezu alle Teile des Körpers 2. Daher sind einige frühe Studien bereits intravital Bildgebung der Leber 3,4 eingesetzt. Es gibt jedoch einige Einschränkungen auf dem neuesten Stand in Bezug auf langzeitstabil hochauflösende Bildgebung von Lebergewebe.
Aufgrund der anatomischen Position der Leber in engem Kontakt mit der Membran und dem Gastrointestinaltrakt 5, das häufigste Problem für mikroskopische intravitalen Bildgebung Bewegung aufgrund der Atmung und, in geringerem Maße, Peristaltik des Verdauungstraktes 6. Im Vergleich zu anderen soliden Organen, ist die Leberchirurgie eine besondere Herausforderung. Aufgrund der dichten mikrovaskuläre Struktur kann chirurgische Manipulation zu massiven hämorrhagische Läsionen führen, Mikrozirkulationsstörungen 7 und auch die Aktivierung der ansässigen immune Zellen, wie Kupffer-Zelle 8. Daher mechanische Fixierung des Gewebes wie anderswo veröffentlicht 6,9 ist wahrscheinlich mit dem Intravitalmikroskopie Abbildungs stören.
In einer gesunden Leber, 10-15% des Gesamtblutvolumens befindet sich innerhalb der Leber Gefäßsystem und das Organ erhält etwa 25% des Gesamtherzleistung 10, wodurch das Organ sehr anfällig für Veränderungen in der Blutzirkulation (zB Blutdruckschwankungen ). Daher werden Störungen in der Leberdurchblutung aufgrund zB Schubspannung, Vertreibung, Verletzungen, die durch eine übermäßige Gewebebehandlung oder zentrale Zirkulation künstliche Veränderungen der Leukozyten Zugverhalten, eingeschränkter Lebersauerstoffversorgung und damit weitere Leberschäden sowie führen, beeinflussen Leber Immunreaktionen als Organkonservierung und die Gesamtlebenszeit des Tieres.
Frühe mikroskopischen Untersuchungen wurden an Intravital Epifluoreszenz mi basiertMikroskopie, aber einige technische Einschränkungen wie Fotobleichung und geringe Eindringtiefe begrenzen den Einsatz dieser Technik für die langfristige Leber-Bildgebung 4,11,12. Mit der Entwicklung der Multiphotonen-Mikroskopie in den 1990er Jahren wurden die Grenzen der Fotobleichung oder Eindringtiefe im Wesentlichen gelöst, wie diese neue Methode technisch in der Lage, um bildgebende Studien in nahezu allen Organen unter realen Situationen 13-15 durchzuführen war. Jedoch sind die Haupt verbleibenden Herausforderungen bezüglich Bildgebung der Leber waren: Atembewegung, Autofluoreszenz von Lebergewebe, die Sicherung unveränderten Durchblutung der Leber-Sinusoiden und besonders stabile Bildgebung für längere Zeiträume von mehreren Stunden 16.
Obwohl mehrere Studien behandelt die Funktion und die Wanderung von verschiedenen Leukozyten in der Leber 17, zB NKT-Zellen 18-20, T-Zellen 21,22, Leber Makrophagen oder Neutrophile 23,24 25, langfristige Multi microscopy Abbildungs noch nicht erfolgreich hergestellt wurde, die Aufgabe noch schwieriger bei Tieren mit akuten oder chronischen Lebererkrankung aufgrund der vorhandenen Schäden und damit eine höhere Anfälligkeit für weitere Schäden 26. Allerdings, Überwachungs- Zugverhalten und zelluläre Funktion von Leukozyten in der Leber und in Echtzeit ermöglicht neue Einblicke in ihre jeweilige Rolle bei Leber Homöostase und Krankheits 27.
Das Chemokinrezeptor CXCR6 an mehreren Lymphozytensubsets, einschließlich natürlicher Killerzellen (NK), NKT-Zellen und einige T-Zell-Populationen 18,28 ausgedrückt. Frühere Studien an Mäusen haben gezeigt, dass CXCR6 und ihre zugehörigen Liganden CXCL16 kann die Patrouillen der NKT-Zellen auf Lebersinusoide während Homöostase steuern. Folglich ist die Verwendung von CXCR6.gfp Mäusen (Tragen einer Knock-in-der Green Fluorescent Protein [GFP] im CXCR6 Locus) ist beschrieben worden, um die Migration von Lymphozyten in verschiedenen Organen, wie Gehirn 29 zu untersuchenund auch Leber 18,20 und zeigt bei Entzündungen erhöht Infiltration CXCR6.gfp Zellen.
Mit dem in dieser Studie zur Verfügung gestellten Verfahren war es möglich, diese Prozesse über einen langen Zeitraum unter stabilisierten Bedingungen zu folgen. Die Intravitalmultiphotonen-basiertes Verfahren erlaubt Bildgebung, die in hohem Maße reproduzierbar mit minimaler Störung des Tieres und der Orgel; optimiert für die langfristige Überleben der Tiere durch umfangreiche Überwachungs gefolgt von genaue Kontrolle der Atmung und Kreislauf; und hoch flexibel und leicht auch auf andere parenchymatösen Organen wie Niere oder Milz erlassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel unserer Studie war es, eine hoch standardisierte, stabile und reproduzierbare Methode zur intravital TPLSM Bildgebung der Leber zu entwickeln. Intravital Imaging im Allgemeinen hat wertvolle Einblicke in das Zellverhalten unter realen Bedingungen folgenden Referenzfahrt und der Interaktion verschiedener Leukozyten-Populationen in der Entwicklung, Homöostase und Krankheit gegeben. Die etwas schwierig anatomischen Position der Leber, durch die Atemwege und peristaltische Darmbewegung direkt an die Leber sowie ih…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
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