3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
Intra-thymus T cel ontwikkeling vereist een ingewikkelde driedimensionale maaswerk uit verschillende stromale cellen, dwz niet-T-cellen. Thymocyten doorkruisen deze steiger in een sterk gecoördineerde temporele en ruimtelijke orde, terwijl achtereenvolgens passeren verplichte check points, dwz T-cel lineage inzet, gevolgd door T-cel-receptor repertoire generatie en selectie vóór de uitvoer in de periferie. De twee belangrijkste bewoner celtypes vormen deze steiger zijn corticale (cTECs) en medullaire thymus epitheelcellen (mTECs). Een belangrijk kenmerk van mTECs is de zogenaamde promiscue expressie van verschillende weefsel-beperkte antigenen. Deze weefsel beperkte antigenen worden gepresenteerd aan thymocyten direct of indirect onvolwassen door mTECs of thymus dendritische cellen, respectievelijk resulterend in zelf-tolerantie.
Geschikte in vitro modellen emuleren de ontwikkelingstrajecten en functies van cTECs en mTECs zijn lacking. Dit gebrek aan adequate experimentele modellen is bijvoorbeeld bemoeilijkt de analyse van promiscue genexpressie, die nog steeds slecht begrepen op cellulair en moleculair niveau. We pasten een 3D organotypische co-cultuur model tot cultuur ex vivo geïsoleerde mTECs. Dit model werd oorspronkelijk ontworpen om keratinocyten kweken op zodanige wijze dat een huidequivalent in vitro genereren. Het 3D-model behouden belangrijke functionele kenmerken van MTEC biologie: (i) proliferatie en terminale differentiatie van CD80 lo, Aire-negatief in CD80 hi, Aire-positieve mTECs, (ii) respons op RANKL, en (iii) aanhoudende expressie van FoxN1, aire en weefsel beperkt genen in CD80 hi mTECs.
Introduction
Ontwikkeling thymocyten maken ongeveer 98% van de thymus, terwijl de resterende 2% uit diverse cellen die tezamen vormen het thymus stroma (bijvoorbeeld epitheliale cellen, dendritische cellen, macrofagen, B-cellen, fibroblasten, endotheelcellen). De buitenste corticale epitheelcellen (cTECs) verwerven immigratie van pro-T-cellen van het beenmerg, T cellijn inductie bij multipotente pre-T-cellen en positieve selectie van zelf-MHC beperkte onrijpe thymocyten. De binnenste medullaire thymus epitheelcellen (mTECs) zijn betrokken bij inductie van de thymocyten met hoge affiniteit TCR voor zelf-peptide / MHC-complexen door ofwel induceren negatieve selectie of de afwijking in de regulatoire T-cellijn. In het kader van de centrale tolerantie inductie, mTECs zijn uniek in dat ze drukken een breed spectrum van weefsel beperkt zelf-antigenen (TRA) dus mirroring de perifere zelf. Dit fenomeen wordt promiscue genexpressie genoemd (PGE)1,2.
De meeste huidige studies over deze fascinerende celtype afhankelijk ex vivo geïsoleerde cellen, diverse korte 2D kweeksystemen steeds resulteerde in het verlies van PGE en belangrijke regulator moleculen zoals MHC klasse II, FoxN1 en Aire binnen de eerste 2 dagen 3-6 . Het bleef echter onduidelijk welke bepaalde componenten en eigenschappen van het intacte 3D maaswerk van de thymus ontbraken in 2D modellen. De re-aggregatie thymus orgaankweek (RTOC) heeft tot nu toe de enige 3D-systeem dat de studie van T-celontwikkeling mogelijk maakt, enerzijds, en stromale celbiologie, daarentegen is, in een intacte thymus micromilieu 7. Toch RTOCs bepaalde beperkingen, dat wil zeggen, zij bevatten reeds een complex mengsel van cellen, input nodig foetale bindweefselcellen en doorstaan een maximale kweekperiode van 5-10 dagen.
Het ontbreken van reductionistisch in vitro kweeksystemen heeft de studie van belemmerdverschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling en thymus organogenese niet in het minst de moleculaire regulatie van PGE en haar relatie tot de ontwikkelingsbiologie van mTECs.
Door de nauwe verbondenheid van de gestructureerde organisatie van de epitheelcellen van de huid en de thymus, hebben we gekozen voor een 3D organotypische cultuur (OTC) systeem dat oorspronkelijk was ontwikkeld om de differentiatie van keratinocyten in vitro na te bootsen en zo een dermale equivalent. De OTC bestaat uit een inerte scaffold matrix bedekt met dermale fibroblasten die zijn gevangen in een fibrinegel, waarop keratinocyten geënt 8,9. Hier hebben we vervangen keratinocyten met gezuiverd mTECs. Terwijl de fundamentele kenmerken van dit model, we geoptimaliseerd bepaalde parameters.
In de vastgestelde OTC model mTECs verspreidden, onderging terminale differentiatie en onderhouden Mtec identiteit en PGE, dus nauw nabootsen in vivo mTECs ontwikkeling <sup> 10. Deze technische notitie geeft een gedetailleerd protocol waardoor de stapsgewijze set-up van de thymus OTC's.
Protocol
Representative Results
Discussion
Naast RTOCs zijn de 3D OTC's qua TEC differentiatie en PGE onderhoud / inductie (Tabel 1) in vergelijking met andere (i) "vereenvoudigde 3D cultures 'met verreweg superieur – fibroblasten alleen zonder het skelet; (Ii) 2D systemen met – fibroblasten / feeder-cellen samen gekweekt met TEC 10, (iii) 3T3-J2 cellen waarbij TEC klonen ontwikkelen, maar PGE verloren, (iv) Matrigel of (v) ECM componenten (ongepubliceerde gegevens). PGE werd gehandhaafd voor maximaal 7 dagen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
References
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
- Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
- Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
- Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
- Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
- Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
- Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).
