Elektrospundne Nanofiber Stilladser med inddeling i Fiber Organization

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at fabrikere elektrospundet nanofiber stilladser med fordelte toner organisering af fibre og udforske deres ansøgninger i regulering cellemorfologi / orientering. Forløb med hensyn til fysiske og kemiske egenskaber af nanofiber stilladser tilbyder en bred vifte af applikationer inden for det biomedicinske område.

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduction

Nanofibre er et populært værktøj til vævsmanipulering grund af deres evne til at efterligne den ekstracellulære matrix i sin struktur og relative størrelse ^1. Men nogle native vævsgrænseflader, såsom sene-til-knogle insertionssted, indeholder collagenfibre, som udviser en variabel organisationsstruktur, der øger i tilpasning til senen og falder ved knoglen stedet ^2-5. Så for effektiv vævsregeneration der er behov for at fremstille et stillads, der effektivt kunne efterligne denne strukturelle gradient.

Tidligere har der været forskning udført på gradvise ændringer i fibersammensætning, specifikt indhold af mineraler ^6. Men genskabe den strukturelle komponent af bindevæv stort set uudforsket. En tidligere undersøgelse undersøgte morfologiske gradienter ved at studere effekten af ​​overfladen silica partikeldensitet om spredning af rotte calvariale osteoblaster og fandt en InverSE forholdet mellem silica partikeldensitet og celleproliferation ^7. Men de morfologiske ændringer, medieret celleproliferation i tidligere arbejde var for det meste relateret til overfladen ruhed mangler kapacitet i efterligne fiber organisationsændringer ^7,8. En nylig undersøgelse har forsøgt at fremstille et stillads, som efterlignede de unikke collagen fiberorienteringer ved hjælp af en hidtil ukendt kollektor til elektrospinding ^9. Selv om denne undersøgelse lykkedes at fremstille et stillads med både linie og tilfældige fibre, undlod at efterligne gradvise ændringer udstillet i de indfødte væv. Også i produktion separate komponenter, med en øjeblikkelig ændring fra linie til tilfældig orientering, de biomekaniske egenskaber af denne stillads faldt betydeligt. Ingen tidligere arbejde har været i stand til at producere gældende nanofiber stilladser med kontinuerlige overgange i fiberorienteringer fra aligned og tilfældig. Vores seneste undersøgelse har vist vellykket genskabelse af nanofiber stilladsermed inddeling i fiber organisation, der kan potentielt efterligner native collagen organisation sene-til-bone indsættelse ^10. Dette arbejde har til formål at præsentere de protokoller, der anvendes til produktion af nanofiber stilladser med en struktur, der ligner den, fiber organisation i native sene-til-knoglevæv interface.

Gradient nanofiber strukturer potentielt vidtrækkende applikationer på tværs af en række forskellige områder. Vi fokuserede på de ansøgninger til tissue engineering af senen-til-bone insertionssted ved at kombinere vores stilladser med adipøst afledte stamceller (ADSCs), der allerede anvendes til vævsregeneration på forskellige substrater ^11-14. Desuden ADSCs er meget ens i naturen til knoglemarv stamceller i form af multipotency og deres ressourcer er rigeligt der kan høstes ved hjælp af en simpel fedtsugning ^15,16. Seeding disse celler til nuancerede nanofiber stilladser yderligere øger deres tissagsøge ingeniørmæssige anvendelser ved at tillade kontrolleret distribution af de celler, der potentielt kan differentiere til forskellige væv. Ud over at podning stamceller kan nanofibre være indkapslet med signalmolekyler for regulering af cellulær reaktion. Kobling nanoencapsulation med den organisatoriske gradient af disse scaffolds muliggør studiet af cellulære adfærd eller mulige implantat design og belægninger. Indkapsling af funktionelle molekyler som knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2), som er blevet vist at inducere osteoblastdifferentiering ^15,16, yderligere forbedre vævsdyrkningsapplikationer disse scaffolds ^10.

Protocol

1. Fremstilling af opløsningen Der fremstilles en opløsning af poly (ε-caprolacton) (PCL) (Mw = 80.000 g / mol) ved en omtrentlig koncentration på 100 mg / ml. Opløs PCL i en blanding af dichlormethan (DCM) og N, N-dimethlyformamide (DMF) i et forhold på 4: 1 (v / v) med en koncentration på 10% (w / v). Placer opløsning i et 20 ml glasrør for at blande. Placer glasrør i ultralydsrenser i 30 minutter, eller indtil opløsningen er gennemskinnelig. …

Representative Results

Ved anvendelse af denne protokol blev en fibermåtte med en organisatorisk gradient dannet. Figur 3 viser SEM billeder taget på forskellige steder på nanofiber stilladset. Kvalitativt kan det bestemmes, at der er en progression fra uniaksialt aligned fibre ved 0 mm (figur 3A) til en tilfældig fiber sortiment på 6 mm (figur 3D). FFT giver en kvantitativ værdi for fiber justering detaljerne om kvantitative fremgangsmåder er detaljeret her 19. Fibre ved 0 …

Discussion

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu…

Materials

Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2