Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.
Abstract
The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.
Introduction
Nanofibers הוא כלי פופולרי להנדסת רקמות בגלל היכולת שלהם לחקות את המטריצה תאית במבנה שלה וגודלה היחסי 1. עם זאת, חלק מממשקים האם של הרקמה, כגון אתר הכנסת גיד לעצם, מכילים סיבי קולגן, אשר מפגינים מבנה ארגוני משתנה שמגדיל ביישור לגיד ופוחת באתר העצם 2-5. אז, לשחזור רקמות יעילות יש צורך לפברק פיגום שיכול ביעילות לחקות שיפוע מבני זו.
מחקר בעבר, חל נערך על שינויים הדרגתיים בהרכב סיבים, במיוחד, תכולת מינרלים 6. עם זאת, יצירה מחדש של המרכיב המבני של רקמות חיבור נשארה נחקרה במידה רבה. מחקר מוקדם יותר בדק הדרגתיים מורפולוגיים על ידי לימוד ההשפעה של צפיפות חלקיקי סיליקה משטח על ההתפשטות של osteoblasts calvarial החולדה ומצא Inverמערכת יחסים בין se צפיפות חלקיקי סיליקה ותא התפשטות 7. אבל השינויים מורפולוגיים שתיווך שגשוג תאים בעבודה קודמת היו בעיקר קשורים למשטח חספוס חסר היכולת במחק שינויים ארגוניים סיבים 7,8. אחד מחקרים אחרונים ניסו לפברק פיגום שחיקה אוריינטציות קולגן סיבים הייחודיות באמצעות אספן חדשני לelectrospinning 9. בעוד מחקר זה הצליח לייצר פיגום עם סיבים שני מיושרים ואקראיים, היא לא הצליחה לחקות את השינויים הדרגתיים שהוצגו ברקמות המקומיות. כמו כן, בייצור רכיבים נפרדים, עם שינוי מיידי ממיושר לכיוון אקראי, המאפיינים ביו-המכאניים של פיגום זה ירד באופן משמעותי. אין עבודה קודמת הצליחה לייצר פיגומי nanofiber ישימים עם דרגות רציפות באורינטציות סיבים ממיושרים ואקראי. המחקר שנערך לאחרונה שלנו הראה בילוי מוצלח של פיגומי nanofiberעם דרגות בארגון סיבים שעלולים לחקות את הארגון האם של קולגן בגיד לעצם ההכנסה 10. עבודה זו מבקשת להציג את הפרוטוקולים המשמשים לייצור פיגומי nanofiber עם מבנה דומה מאוד לזו של ארגון סיבים בממשק רקמת גיד לעצם הילידים.
מבני nanofiber Gradient יש פוטנציאל מרחיק לכת יישומים על פני מגוון רחב של תחומים. אנחנו מתמקדים ביישומים להנדסת רקמות של אתר הכנסת גיד לעצם על ידי שילוב של הפיגומים שלנו עם תאי שמקורם שומן גזע (ADSCs) שכבר מנוצלים לשחזור רקמות על מצעים שונים 11-14. בנוסף, ADSCs דומה מאוד באופיים לתאי גזע של מח עצם במונחים של multipotency והמשאבים שלהם הוא בשפע שניתן לקצור באמצעות 15,16 הליך שאיבת שומן פשוט. זריעת תאים אלה לפיגומי nanofiber מדורגים משפרת עוד יותר את tisלתבוע יישומים הנדסיים כך שהוא מאפשר להפצה מבוקרת של התאים שיכולים להתמיין לרקמות שעלולים להיות שונות. בנוסף לזריעת תאי גזע, יכול להיות במארז nanofibers עם מולקולות איתות לרגולציה של תגובה תאית. צימוד nanoencapsulation עם השיפוע הארגוני של פיגומים אלה מאפשר לחקר התנהגות סלולרית או עיצובי שתל אפשריים וציפויים. Encapsulation של מולקולות חלבון פונקציונליות כמו עצם המוךפו"גנטי 2 (BMP2), אשר הוכח לגרום להתמיינות תא עצם 15,16, עוד יכול לשפר את יישומי הנדסת רקמות של פיגומים אלה 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.
Fu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה באופן חלקי מקופות הפעלה ממרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה ומכון הלאומי לבריאות (מספר מענק 1R15 AR063901-01).
Materials
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion – What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. ‘Aligned-to-random’ nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
