Electrospun nanofiber Ställningar med Graderingar i Fiber Organization

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att tillverka electrospun nanofiber ställningar med graderade organisation av fibrer och utforska sina ansökningar i regleringen cellmorfologi / orientering. Lutningar beträffande fysikaliska och kemiska egenskaper hos nanofiber byggnadsställningar erbjuder ett brett utbud av tillämpningar inom det biomedicinska området.

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduction

Nanofiber är en populär verktyg för vävnadsteknik på grund av deras förmåga att imitera den extracellulära matrisen i sin struktur och relativa storlek ^1. Men vissa nativa vävnadskontaktytorna, såsom den sena-till-ben insättningsstället, innehåller kollagenfibrer, vilka uppvisar en variabel organisationsstruktur som ökar i inriktning mot senan och minskar vid benet plats ^2-5. Så, för effektiv regenerering av vävnad föreligger ett behov att tillverka en byggnadsställning som effektivt skulle kunna imitera denna strukturella gradient.

Tidigare har det funnits forskning utförts på gradvisa förändringar i fibersammansättning, närmare bestämt mineralinnehåll ^6. Men åter den strukturella delen av bindväv i stort sett outforskat. En tidigare studie undersökte morfologiska gradienter genom att studera effekten av ytan kiseldioxid partikeldensitet på spridningen av rått calvarial osteoblaster och hittade en Inverse samband mellan kiseldioxid partikeldensitet och celltillväxt ^7. Men de morfologiska förändringar som förmedlade celldelningen i tidigare arbete var mestadels relaterade till ytan grovhet saknar förmåga i likna fiber organisationsförändringar ^7,8. En färsk studie försökte tillverka en byggnadsställning som härmade de unika kollagenfiberoriente med hjälp av en ny uppsamlare för elektrospinning ^9. Även denna studie lyckats framställa en byggnadsställning med både linje och slumpmässiga fibrer, underlåtit att efterlikna de gradvisa förändringar utställda i de infödda vävnaderna. Också, att producera separata komponenter, med en omedelbar förändring från linje till slumpvis orientering, de biomekaniska egenskaperna för denna byggnadsställning minskat betydligt. Ingen tidigare arbete har kunnat producera gällande nanofibrer ställningar med kontinuerliga nyanser i fiberoriente från inriktade och slumpmässiga. Vår senaste studie har visat framgångsrikt rekreation av nanofiber byggnadsställningarmed graderingar i fiber organisation som potentiellt kan imitera infödda kollagenorganisationen på senan till ben insättning ^10. Detta arbete syftar till att presentera de protokoll som används för produktion av nanofiber ställningar med en struktur som liknar den hos fiber organisation i infödda senan till benvävnad gränssnitt.

Gradient nanofiber strukturer har potentiellt långtgående program inom en rad områden. Vi fokuserade på ansökningarna till vävnadsteknik av senan till ben insticksstället genom att kombinera våra ställningar med adipos-härledda stamceller (ADSCs) som redan utnyttjas för vävnadsregenerering på olika substrat ^11-14. Dessutom ADSCs är mycket lika i naturen för att benmärgsstamceller i termer av multipotens och deras resurser är riklig som kan skördas med hjälp av en enkel fettsugning förfarande ^15,16. Sådd dessa celler att graderade nanofiber ställningar ytterligare ökar deras tisstämma tekniska tillämpningar genom att tillåta för kontrollerad fördelning av celler som potentiellt kan differentieras till olika vävnader. Förutom att sådd stamceller, kan nanofibrer kapslas in med signalmolekyler för reglering av cellulärt svar. Koppling nanoencapsulation med organisations lutning av dessa ställningar möjliggör studier av cellulära beteende eller möjliga implantat mönster och beläggningar. Inkapsling av funktionella molekyler som benmorfogenesprotein 2 (BMP2), vilket har visat sig inducera osteoblaster differentiering ^15,16, kunde ytterligare öka vävnadstekniska tillämpningar av dessa ställningar ^10.

Protocol

1. Beredning av lösningen Bered en lösning av poly (ε-kaprolakton) (PCL) (Mw = 80000 g / mol) vid en ungefärlig koncentration av 100 mg / ml. Lös PCL i en blandning av diklormetan (DCM) och N, N-dimethlyformamide (DMF) vid ett förhållande av 4: 1 (volym / volym) med en koncentration av 10% (vikt / volym). Placera lösningen i en 20 ml glasröret för blandning. Placera glasröret i ultraljud renare i 30 minuter, eller tills lösningen är genomskinlig. <p class="jove_titl…

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll, var en fibermatta med en organisatorisk gradient bildas. Figur 3 visar SEM-bilder tagna vid olika platser på nanofiber schavotten. Kvalitativt kan det bestämmas att det finns en progression från enaxligt inriktade fibrerna vid 0 mm (Figur 3A) till en slumpmässig fiber sortiment på 6 mm (figur 3D). FFT ger ett kvantitativt värde på fiber anpassning, detaljerna på de kvantitativa processerna är detaljerade här 19. Fibrer…

Discussion

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu…

Materials

Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2