Elektrospunnede nanofiber Stillas med graderinger i Fiber Organization

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å dikte elektrospunnede nanofiber stillasene med graderte organisering av fiber og utforske sine applikasjoner i å regulere cellemorfologi / orientering. Gradienter med hensyn til fysiske og kjemiske egenskaper av nanofiber stillasene tilbyr et bredt utvalg av applikasjoner i biomedisinske feltet.

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduction

Nanofibers er populære verktøy for regenerering av vev på grunn av deres evne til å etterligne den ekstracellulære matriks i sin struktur og relative størrelse ^1. Men noen opprinnelige vev-grensesnitt, for eksempel sene-knokkel-innføringssted, inneholde kollagenfibre, som oppviser en variabel organisasjonsstruktur som øker i flukt mot sene og avtar på benet området ^2-5. Så, for effektiv regenerering av vev er det behov for å fremstille et stillas som effektivt kunne etterligne denne strukturelle gradient.

Tidligere har det vært foretatt forskning på gradvise endringer i fibersammensetningen, spesielt mineralinnhold ^6. Imidlertid gjenskape den strukturelle komponenten av bindevev forblir stort sett uutforsket. En tidligere studie undersøkte morfologiske gradienter ved å studere effekten av overflaten silika partikkeltetthet på spredning av rotte calvarial osteoblaster og fant en inverterse sammenhengen mellom silika partikkeltetthet og celleproliferasjon ^7. Men de morfologiske endringer som medierte celleproliferasjon i tidligere arbeid var for det meste relatert til overflaten ruhet mangler evnen i hermet fiberorganisasjonsendringer ^7,8. En fersk studie forsøkt å dikte et stillas som etterlignet den unike kollagen fiber orientering ved hjelp av en roman oppsamler for electro ^9. Selv om denne studien lykkes i å produsere et stillas med både justert og tilfeldige fiber, klarte det å etterligne de gradvise endringer utstilt i de innfødte vev. Også, i å produsere separate komponenter, med en umiddelbar endring fra justert til tilfeldig orientering, biomekaniske egenskapene til dette stillaset sunket betraktelig. Ingen tidligere arbeid har vært i stand til å produsere gjeldende nanofiber stillasene med kontinuerlige graderinger i fiber orienteringer fra aligned og tilfeldig. Vår fersk studie har vist vellykket rekreasjon av nanofiber stillasermed graderinger i fiber organisasjon som potensielt kan etterligne den opprinnelige kollagen organisasjon på sene-til-ben innsetting ^10. Dette arbeidet tar sikte på å presentere de protokollene som brukes til produksjon av nanofiber stillasene med en struktur som minner sterkt om fiber organisasjon i mors sene-til-benvev grensesnitt.

Gradient nanofiber strukturer har potensielt vidtrekkende applikasjoner på tvers av en rekke felt. Vi fokuserte på søknadene til tissue engineering av den sene-til-ben innstikkstedet ved å kombinere våre stillaser med adipose-avledet stamceller (ADSCs) som allerede benyttes for vev regenerering på ulike underlag ^11-14. I tillegg ADSCs er svært like i naturen til benmarg stamceller i form av multipotency og deres ressurs er rikelig som kan høstes ved hjelp av en enkel fettsuging prosedyre ^15,16. Seeding disse cellene til graderte nanofiber stillaser ytterligere forbedrer sin tissaksøke tekniske applikasjoner ved å tillate for kontrollert distribusjon av cellene som potensielt kan differensiere i ulike vev. I tillegg til såing stamceller, kan nanofibers innkapsles med signalmolekyler for regulering av cellulær respons. Kobling nanoencapsulation med organisasjons gradient av disse stillasene åpner for studiet av mobilnettet atferd eller mulige implantat design og belegg. Innkapsling av funksjonelle molekyler som benmorfogenetisk protein 2 (BNIP2), som er blitt vist å indusere osteoblastdifferensierings ^15,16, ytterligere kan forbedre vev tekniske anvendelser av disse stillaser ^10.

Protocol

1. Utarbeidelse av løsningen Fremstille en løsning av poly (ε-kaprolakton) (PCL) (Mw = 80000 g / mol) ved en omtrentlig konsentrasjon på 100 mg / ml. Oppløs PCL i en blanding av diklormetan (DCM) og N, N-dimetylformamid (DMF) i et forhold på 4: 1 (v / v) med en konsentrasjon på 10% (w / v). Plassere løsningen i et 20 ml glassrør for blanding. Plasser glassrør inn i ultralydrenser i 30 minutter, eller inntil oppløsningen er gjennomskinnelig. 2. I…

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen, ble en fibermatte med en organisatorisk gradient dannet. Figur 3 viser SEM bilder tatt på forskjellige steder på nanofiber stillaset. Kvalitativt, kan det bestemmes at det er en progresjon fra de uniaksialt orienterte fibre ved 0 mm (figur 3A) til en tilfeldig fiber sortiment på 6 mm (figur 3D). FFT gir en kvantitativ verdi for den fiberinnrettings, detaljene på de kvantitative fremgangsmåter er beskrevet her 19. Fibrene v…

Discussion

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu…

Materials

Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2