작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도
Summary
Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS)은 기초 연구와 번역 애플리케이션에 사용할 수 차 심근 세포의 부족을 해결하기위한 중요한 셀 소스되고있다. 심근에 hiPSCs 차별화, 배아 체 (EB) 기반 분화 및 성장 인자 유도를 포함하는 다양한 프로토콜들이 개발되었다. 그러나, 이들 프로토콜은 비효율적 정제 심근 세포를 생성하는 능력에서 매우 다양하다. 최근의 Wnt / β-catenin의 신호의 작은 분자 기반 프로토콜을 사용하는 변조는 높은 효율로 심장 분화를 촉진 것으로 나타났다. 이 프로토콜로, 분화 된 세포의 50 % 초과 -60 % 심장 트로포 닌 양성 심근 세포가 지속적으로 관찰했다. 또 심근 순도를 증가시키기 위해, 구체적으로는 분화 세포 대사 차이에 기초하여 비 – 심근 세포를 제거하는 기아 글루코스 행 하였다심근 세포와 비 심근 세포 사이의. 이 선택 전략을 사용하여, 우리는 지속적으로 분화 된 세포의 집단에서 비 심근에 심근의 비율보다 30 % 증가를 획득. 이러한 고순도 심근 질환 체외 모델링 연구 및 약물 스크리닝 분석법 인간 IPSC 기반 결과의 신뢰성을 향상한다.
Introduction
차 인간 심근 인해 침습 심장 생검 및 배양 때문에 열악 장기 세포 생존의 단일 셀에 대한 해리 곤란한 요구 사항으로 얻는 것이 곤란하다. 차 인간의 심근 세포, 환자 맞춤형 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 부족을 감안할 때 (hiPSC-CM) 기술은 기초 연구에 대한 강력한 대안 심근 소스뿐만 아니라 질병 모델링 및 약물 임상 및 번역 응용 프로그램으로 간주되었습니다 발견 한. 심근 세포로 다 능성 줄기 세포를 분화 이른 노력 배양체 EBS ()을 사용하여 분화 프로토콜을 채용하지만, EB의 셀 종종으로 25 % 이상이 심근 2,3- 치기 때문에이 방법은 제조 심장 근세포에서 비효율적이다. 비교적, 및 BMP4를 티빈 사이토 카인을 사용하여 단층 계 분화 프로토콜 EB를보다 높은 효율을 표시하지만이 프로토콜은, 여전히 상대적으로 비효율적이다 인간 다 능성 줄기 세포 (4)의 제한된 수의 비싼 성장 인자, 및 전용 기능을 필요로한다. 최근 고효율 hiPSC 단층 계 심근 분화 프로토콜의 Wnt / β 카테닌 5 변조 신호에 의해 개발되었다. 이러한 hiPSC-CMS는 심장 트로포 닌 T와 알파 티닌, 심근 6의 표준 마커 두 sarcomeric 단백질을 표현한다. 프로토콜은 여기에 설명이 저분자 계, 피더 무 세포 단일 층 분화 방법 5,7의 적응이다. 우리는 7-10일 (그림 1) 이후 hiPSCs에서 심근 세포를 구타 얻을 수 있습니다. 그러나 50 %는 세포를 치고 그 결과 심근 세포의 분화에 따라 지속적으로 면역 염색하는 등 심장 관련 트로포 닌 T와 알파 – 티닌과 같은 심근 특정 마커에 대한 부정적 비 심근 세포의 인구의 존재를 보여줍니다. 푸에rther가 심근 세포를 정제 및 비 심근 제거 이기종 분화 된 세포 집단은 일 대 다수의 매우 낮은 글루코스 배지 (도 2)로 처리하여 기아 글루코스 행 하였다. 이러한 처리는 선택적으로 낮은 글루코스 8 환경에서 생존하기 위해 주 에너지 원으로 락트산을 대사하는 심근 세포의 능력으로 인해 비 심근 아니지만 비 심근 세포를 제거한다. 이 정제 단계 이후에, 비 심장 근세포로 심근 세포의 비율이 40 % 증가 (도 3,도 4)이 관측되고, 이러한 셀 하류 유전자 발현 분석, 질병 모델링, 및 약물 스크리닝 분석에 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
고순도 hiPSC 유래 심근 세포를 다량 획득하는 기본 심장 연구뿐 아니라 임상 및 병진 애플리케이션에 중요하다. 심장 분화 프로토콜은 작은 분자 변조 및 단층 기반의 방법 (5)에 마지막으로 심인성 성장을 이용하여 배아 몸 기반 방식에서 전환, 최근 몇 년 동안 엄청난 개선을 시행 샌드위치 방법 (12) – 매트릭스, 2 인자하고있다. 전술 한 프로토콜, 여기에서 설명한 프로토?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
| DMSO | Sigma | D-2650 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
| IWR1 | Sigma | I0161 |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
| Accutase | Millipore | SCR005 |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
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