اشتقاق العضلية العالية النقاء من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية عن طريق صغير التمايز التضمين جزيء واللاحقة الجلوكوز المجاعة
Summary
Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Abstract
أصبحت الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان المستمدة من الخلايا العضلية (hiPSC-CMS) مصدر خلية المهم معالجة نقص العضلية الأولية المتاحة للبحث ومتعدية التطبيقات الأساسية. التفريق hiPSCs إلى العضلية، تم وضع بروتوكولات مختلفة بما في ذلك الجسم مضغي الشكل (EB) التمايز المستندة إلى وعامل النمو الاستقراء. ومع ذلك، هذه البروتوكولات غير فعالة ومتغيرة بشكل كبير في قدرتها على توليد العضلية المنقى. مؤخرا، تبين وجود بروتوكول استخدام التشكيل القائم على جزيء صغير من WNT / β-كاتينين إشارات لتعزيز التمايز القلب مع كفاءة عالية. مع هذا البروتوكول، وكانت أكبر من 50٪ -60٪ من الخلايا التمييزية، لوحظت العضلية-تروبونين إيجابي القلب باستمرار. لزيادة cardiomyocyte النقاء، وتعرض خلايا متباينة إلى جلوكوز للقضاء على الجوع على وجه التحديد غير العضلية على أساس الفرق الأيضالصورة بين العضلية وغير العضلية. باستخدام هذه الاستراتيجية الاختيار، وحصلنا على الدوام زيادة أكبر من 30٪ في نسبة العضلية لغير العضلية في عدد سكانها خلايا متمايزة. وينبغي لهذه العضلية العالية النقاء تعزيز موثوقية النتائج من الإنسان المستندة إلى IPSC في دراسات النمذجة المرض في المختبر والمقايسات فحص المخدرات.
Introduction
العضلية الإنسان الأساسية ويصعب الحصول على بسبب اشتراط الخزعات القلب الغازية، وصعوبة في النأي إلى الخلايا واحدة، وبسبب بقاء الخلية الفقراء على المدى الطويل في الثقافة. ونظرا لهذا النقص في العضلية الإنسان الأساسية، من صنع الإنسان الجذعية المحفزة المشتقة من خلية cardiomyocyte المريض محددة وقد اعتبر (hiPSC-CM) التكنولوجيا كمصدر cardiomyocyte بديل قوي للبحوث الأساسية فضلا عن التطبيقات السريرية ومتعدية مثل النمذجة المرض والمخدرات اكتشاف 1. الجهود المبكرة في تمييز الخلايا الجذعية المحفزة إلى العضلية المستخدمة بروتوكولات التمايز باستخدام الهيئات مضغي الشكل (EBS)، ولكن هذه الطريقة غير فعالة في إنتاج العضلية لأنه في كثير من الأحيان أقل من 25٪ من الخلايا في EB والضرب العضلية 2،3. نسبيا، وبروتوكول التمايز القائم على أحادي الطبقة باستخدام السيتوكينات activin ألف وBMP4 عرض كفاءة أعلى من EBS، ولكنهذا البروتوكول لا يزال غير فعالة نسبيا، ويتطلب عوامل النمو مكلفة، والوظائف الوحيدة في عدد محدود من المحفزة الإنسان خطوط الخلايا الجذعية 4. مؤخرا، تم تطوير كفاءة عالية، ومقرها أحادي الطبقة-hiPSC بروتوكول cardiomyocyte التمايز عن طريق تحوير WNT / β-كاتينين يشير 5. هذه hiPSC للتدابير المضادة التعبير عن القلب تروبونين T وألفا actinin، اثنين من البروتينات الساركومير التي هي علامات قياسية من 6 العضلية. بروتوكول يصف هنا هو تطويع هذا صغير القائم على جزيء، تغذية خالية من الخلايا، أحادي الطبقة التمايز طريقة 5،7. ونحن قادرون على الحصول على الضرب العضلية من hiPSCs بعد 7-10 أيام (الشكل 1). ومع ذلك، بعد تمايز cardiomyocyte مما أسفر عن 50٪ تضرب الخلايا، المناعية باستمرار يدل على وجود سكان غير العضلية التي هي سلبية للعلامات cardiomyocyte محددة مثل القلب محددة تروبونين T وألفا actinin. لفوrther تنقية العضلية والقضاء غير العضلية، وتعرض السكان الخلية متباينة غير متجانسة إلى جلوكوز الجوع من خلال معاملتهم مع منخفضة للغاية مستنبت الجلوكوز لأيام متعددة (الشكل 2). هذا العلاج يزيل بشكل انتقائي غير العضلية، نظرا لقدرة العضلية، ولكن ليس غير العضلية، على استقلاب اللاكتات كمصدر أولي للطاقة من أجل البقاء على قيد الحياة في بيئة منخفضة الجلوكوز 8. بعد هذه الخطوة تنقية، لوحظ زيادة 40٪ في نسبة العضلية لغير العضلية، (الشكل 3، الشكل 4) وهذه الخلايا يمكن استخدامها لالمصب تحليل التعبير الجيني، والنمذجة المرض، والمقايسات فحص المخدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحصول على كمية كبيرة من العضلية المستمدة hiPSC العالية النقاء أمر بالغ الأهمية للأبحاث القلب الأساسية فضلا عن التطبيقات السريرية ومتعدية. خضعت بروتوكولات التمايز القلب تحسينات هائلة في السنوات الأخيرة، والانتقال من الأساليب القائمة على الجسم مضغي الشكل باستخدام نم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
| DMSO | Sigma | D-2650 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
| IWR1 | Sigma | I0161 |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
| Accutase | Millipore | SCR005 |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
