Härledning av renat Cardiomyocytes från Human inducerade pluripotenta stamceller Använda småmolekylära-module Differentiering och Efterföljande Glukos Svält

Summary

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Abstract

Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller som härrör hjärtmuskelceller (hiPSC-CMS) har blivit en viktig cellkälla att åtgärda bristen på primära kardiomyocyter som grundforskning och translationell applikationer. För att skilja hiPSCs till hjärtmuskelceller har olika protokoll inklusive embryoid kropp (EB) -baserad differentiering och tillväxtfaktor induktion utvecklats. Emellertid, dessa protokoll är ineffektiva och mycket varierande i sin förmåga att generera renade kardiomyocyter. Nyligen genomfördes en liten molekyl-baserat protokoll utnyttjar modulering av Wnt / β-catenin signalering visat att främja hjärt differentiering med hög effektivitet. Med detta protokoll, var större än 50% -60% av differentierade celler kardiellt troponin-positiva kardiomyocyter konsekvent observerats. För att ytterligare öka cardiomyocyte renhet, var de differentierade cellerna utsattes för glukos svält för att specifikt eliminera icke-kardiomyocyter baserade på den metaboliska skillnadens mellan kardiomyocyter och icke-hjärtmuskelceller. Med hjälp av denna urvalsstrategi, konsekventa resultat vi en ökning som är större än 30% i förhållandet kardiomyocyter till icke-kardiomyocyter i en population av differentierade celler. Dessa högrenade hjärtmuskelceller bör öka tillförlitligheten av resultaten från human iPSC-baserade in vitro sjukdomsmodelleringsstudier och narkotikascreeninganalyser.

Introduction

Primära humana kardiomyocyter är svåra att erhålla på grund av kravet på invasiva kardiologiska biopsier, svårighet att dissociera till enstaka celler, och på grund av dålig långtidscellöverlevnad i kultur. Givet denna brist på primära humana hjärtmuskelceller, patientspecifika människa inducerade pluripotenta stamceller som härrör cardiomyocyte (hiPSC-CM) teknik har betraktats som ett kraftfullt alternativ cardiomyocyte källa för grundforskning samt kliniska och translation applikationer såsom sjukdomsmodellering och narkotika upptäckt ^en. Tidiga insatser i differentiering pluripotenta stamceller till kardiomyocyter anställd differentieringsprotokoll som använder embryoidkroppar (EBS), men denna metod är ineffektiv i producerande cardiomyocytes eftersom det ofta mindre än 25% av cellerna i en EB är att slå cardiomyocytes ^2,3. Jämförelsevis, ett monolager baserad differentiering protokollet använder cytokinerna Activin A och BMP4 visade en högre verkningsgrad än EBS, menDetta protokoll är fortfarande relativt ineffektiv, kräver dyra tillväxtfaktorer, och bara fungerar i ett begränsat antal mänskliga pluripotenta stamcellslinjer ^4. Nyligen var en mycket effektiv, hiPSC monobaserad cardiomyocyte differentiering protokoll som utvecklats genom att modulera Wnt / β-catenin signalering ^5. Dessa hiPSC-CM uttrycka kardiellt troponin T och alfa actinin, två sarcomeric proteiner som är standard markörer för hjärtmuskelceller ^6. Protokollet beskriver här är en anpassning av denna lilla molekyl-baserade, matarcellfritt, monolager differentiering metod ^5,7. Vi kan få slå cardiomyocytes från hiPSCs efter 7-10 dagar (Figur 1). Men efter en cardiomyocyte differentiering vilket resulterade i 50% slå celler, immunfärgning konsekvent visar att det finns en population av icke-hjärtmuskelceller som är negativa för cardiomyocyte specifika markörer såsom hjärtspecifika troponin T och alfa-actinin. Till further rena hjärtmuskelceller och eliminera icke-kardiomyocyter var heterogena differentierade cellpopulationer utsatt till glukos svält genom att behandla dem med en extremt låg glukosodlingsmedium för flera dagar (Figur 2). Denna behandling selektivt eliminerar icke-kardiomyocyter grund av möjligheten för hjärtmuskelceller, men inte icke-cardiomyocytes, att metabolisera laktat som primär energikälla för att överleva i en låg glukos miljö ^8. Efter detta reningssteg, är en ökning av kvoten mellan kardiomyocyter till icke-hjärtmuskelceller 40% observerats, (figur 3, Figur 4) och dessa celler kan användas för nedströms genuttrycksanalys, sjukdomsmodellering, och drogscreeninganalyser.

Protocol

OBS: Vendor information för alla reagenser som används i detta protokoll har listade i tabell 1 och Materiallista. Alla lösningar och utrustning som kommer i kontakt med cellerna måste vara steril, och aseptisk teknik skall användas i enlighet med detta. Utför alla odlings inkubationer i en fuktad 37 ° C, 5% CO2 inkubator om inte annat anges. I detta protokoll är alla skillnader utförs i 6-brunnars plattor, i vilka hiPSCs sås. Efter differentiering och rening, kan…

Representative Results

De morfologiska förändringar under hiPSC differentiering. Den hiPSC odlas i matarfria plåtar växte som platta, tvådimensionella kolonier. På att nå omkring 85% sammanflytades hiPSCs behandlades med 6 iM CHIR för differentiering (Figur 1A). Betydande mängder av celldöd, ett normalt och vanligt fenomen, observerades efter 24 h av CHIR behandling. Efter två dagar av CHIR behandling, de hiPSCs fortsatte att differentiera mot en mesodermalt öde. I jä…

Discussion

Skaffa en stor mängd högrenade hiPSC-derived kardiomyocyter är avgörande för grundläggande hjärtforskning samt kliniska och translationapplikationer. Hjärtdifferentieringsprotokoll har genomgått enorma förbättringar under de senaste åren, övergår från embryoidkroppar kroppsbaserade metoder som utnyttjar kardiogen tillväxtfaktorer ^2, till matrissandwichmetoder ^12, och slutligen till små molekyl-modulerad och monolager-baserade metoder ^5. Av de ovannämnda protokollen, det…

Materials

Name	Company	Catalog number
Matrigel (9-12 mg/mL)	BD Biosciences	354277
RPMI media	Invitrogen	11835055
Glucose free RPMI media	Invitrogen	11879-020
B27 Minus Insulin	Invitrogen	A1895601
B27 Supplement (w/ insulin)	Invitrogen	17504-044
Pen-strep antibiotic	Invitrogen	15140122
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Cell lifter	Fisher	08-100-240
Cryovial	Fisher (NUNC tubes)	375418
TrypLE Select Enzyme	Invitrogen	12563-011