Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
शरीर में सबसे ऊतकों ~ एक GPA के एक मापांक है, जो 0.1 किलो पास्कल से नरम उपास्थि के लिए 100 किलो पास्कल को मस्तिष्क, अभी तक, इन विट्रो सेल अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे टिशू कल्चर में polystyrene (टीसीपी) पर आयोजित किया जाता है के लिए लेकर एक यंग मापांक के साथ नरम viscoelastic सामग्री रहे हैं । एक यह कठोरता बेमेल बहुत कोशिकाओं को उनके पर्यावरण का जवाब जिस तरह से प्रभावित करता है। शोध के एक उभरते शरीर, 2,3 स्टेम कोशिकाओं को भी शामिल है। एक परिणाम के रूप में चार विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के भाग्य पर सब्सट्रेट कठोरता के प्रभाव elucidating करने के लिए इस प्रकार समर्पित है, कई हाइड्रोजेल कठोरता निर्भर सेल की समझ में सहायता करने के लिए विकसित किया गया है सब्सट्रेट कठोरता सेल भाग्य पर काफी प्रभाव पड़ता है कि सबूत से बढ़ रहा है जबकि polyacrylamide (पीए), 5-7 पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), 8,9 polydimethylsiloxane (PDMS), 10 और alginate सहित जीव विज्ञान। 11, ज्यादातर अध्ययनों पर आयोजित की जाती हैं एस के एक छोटे समूह के साथ एक छोटे पैमानेamples। सेल प्रकार या पर्यावरण की स्थिति दुर्लभ हैं की एक सरणी के लिए सब्सट्रेट कठोरता के प्रभाव पर व्यवस्थित, बहुआयामी अध्ययन करता है। 12
कई होनहार उच्च throughput हाइड्रोजेल प्रौद्योगिकियों खूंटी आधारित प्रोटीन, जकड़न microrods के व्यास और ऊंचाई द्वारा संग्राहक है जहाँ से agarose हाइड्रोजेल microbeads, 14 या माइक्रो और नैनो-छड़ के उत्पादन के लिए 13 microfluidic उपकरणों सहित विकसित किया गया है। 15 बहरहाल , प्रौद्योगिकियों ऐसे substrates के परिष्कृत और प्रयोगशालाओं की सीमित संख्या के लिए उपलब्ध हैं तैयार करने के लिए। कठोरता संग्राहक सेल प्रतिक्रिया को शामिल अधिक से अधिक शोध को लागू करने, लेकिन यह भी यंग मापांक, अर्थात 0.3 की एक physiologically प्रासंगिक रेंज प्रदर्शन करने के लिए केवल सस्ता और सरल नहीं कर रहे हैं, जो polyacrylamide (पीए) जैल का इस्तेमाल -। 300 किलो पास्कल 16-22 हालांकि, फिलीस्तीनी अथॉरिटी के निर्माण की विधियों मौजूदा सेल संस्कृति के लिए जैल श्रम गहन और फलस्वरूप प्रस्तुत करने का कर रहे हैंछोटे समूहों में ared। सेल substrates के रूप में पीए जैल की तैयारी के साथ जुड़े कठिनाइयों के कुछ जैल तैयार रहना होगा कि आवश्यकता से स्टेम: 1) ऑक्सीजन के अभाव में पूरा polymerization की अनुमति देने के लिए, 2) एक फ्लैट और चिकनी सतह के साथ वर्दी सेल की अनुमति के लिए लगाव और प्रसार, और 3) स्थायी रूप से अस्थायी रोकने के लिए सेल संस्कृति डिश के तल से चिपका।
कई समूहों बड़े समूहों में सेल संस्कृति के लिए पीए जैल का उत्पादन करने का प्रयास किया है। Semler एट अल। एक छेद पंच के साथ फिर "कट" थे और 96 अच्छी तरह से प्लेट में रखा गया है, जो पीए जैल तैयार मोटी चादरें। 23 बहरहाल, इस विधि में stiffer जैल, यानी,> 1 किलो पास्कल यंग मापांक में, नरम क्योंकि तक सीमित है जैल, कटौती करने के लिए मुश्किल है, और आसानी से क्षतिग्रस्त "चिपचिपा" हैं। MIH एट अल। जैल सीधे एक गिलास नीचे multiwell थाली में polymerized करने की अनुमति देता है जो एक और अधिक परिष्कृत तकनीक विकसित की है। <sऊपर> 6 यह functionalized गिलास नीचे प्लेटों में जेल समाधान डालने के लिये और एक कस्टम coverglass सरणी के साथ उन्हें "sandwiching" द्वारा जैल बनाने के द्वारा प्राप्त किया गया था। छह हालांकि बहुत होनहार, मामूली बढ़त प्रभाव अभी भी इस तकनीक के साथ मनाया गया। साथ ही, तकनीक कई प्रयोगशालाओं के साथ ही महंगा गिलास नीचे multiwell प्लेटों को तुरंत सुलभ नहीं एक कस्टम डिजाइन सरणी की आवश्यकता है।
इस पत्र में आसानी से किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अपनाया जा सकता है कि एक multiwell थाली में पीए जैल इकट्ठा करने के लिए एक सरल और सस्ता तरीका है वर्णन करता है। से बचाने वाली क्रीम पीए जैल के लिए है जो एक हाइड्रोफोबिक एक, और covalently बयान पर पीए जेल बांधता है जो एक हाइड्रोफिलिक एक, – यहाँ, एक लचीले प्लास्टिक समर्थन के दो पहलू है, जो उपयोग किया जाता है। पीए जेल चादरें लचीले प्लास्टिक समर्थन से चिपका स्थायी रूप से जमा कर रहे हैं और एक बार, यह किसी भी मोटाई या जकड़न की जैल से निपटने के लिए और किसी भी वांछित आकार में उन्हें काटने में सक्षम बनाता है। इस approach है जो एक फिलीस्तीनी अथॉरिटी बाध्यकारी समाधान के साथ, कांच coverslips या महंगा गिलास नीचे multiwell प्लेटों के कुओं या तो अन्यथा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं आकारों में कस्टम प्लास्टिक 'coverslips के' पैदा करता है, लेकिन यह भी कांच की सतहों इलाज के लिए पूर्व आवश्यकता अनावश्यक न केवल एक थकाऊ और एक समय लेने वाली कदम है। अन्त में, वर्दी पीए जैल चादरें बड़े समूहों में तैयार किया है और कई महीनों के लिए डी-हाइड्रेटेड संग्रहित किया जा सकता है।
सारांश में, यहाँ प्रस्तुत परख कई पहलुओं में मौजूदा तरीकों पर एक सुधार है। सबसे पहले, multiwell थाली विधानसभा की प्रक्रिया कुशल है, और आवश्यक सामग्री की कुल लागत कम है। दूसरा, हाइड्रोजेल एक भी सजातीय जेल फिल्म में बड़े समूहों में उत्पादित कर रहे हैं। अंत में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं कि केवल सामग्री के लिए आवश्यक हैं। परख की उपयोगिता सेल आकृति विज्ञान पर सब्सट्रेट कठोरता के प्रभाव की खोज और क्षेत्र के प्रसार के द्वारा सचित्र है।
मूल रूप से वैद्युतकणसंचलन के लिए विकसित polyacrylamide जैल, 28 अब नियमित सेल आकृति विज्ञान, गतिशीलता, और अन्य सेल विशेषताओं के बीच संचार 3,24,29 पर सब्सट्रेट कठोरता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृत?…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Reagents | |||
40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
Disposable lab equipment | |||
flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
UV oven | UVITRON | UV1080 | |
Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |