Abstract
Under hjerte utvikling, generering av hjerteinfarkt spesifikke strukturelle og funksjonelle enheter inkludert sarcomeres, kontraktile myofibrils, interkalerte plater og costameres krever koordinert montering av flere komponenter i tid og rom. Forstyrrelser i montering av disse komponentene fører til utviklingshjertefeil. Immuno-fluorescensfarging teknikker brukes vanligvis i dyrkede kardiomyocytter å sondere myofibril modning, men dette ex vivo tilnærming er begrenset av i hvilken grad myocytter vil fullt skille i kultur, mangel på normale in vivo mekaniske innganger, og fravær av endokardiale signaler. Anvendelse av immunfluorescens teknikker til studiet av utviklingen mus hjerte er ønskelig, men mer teknisk utfordrende, og metoder ofte mangler tilstrekkelig følsomhet og oppløsning for å visualisere sarcomeres i de tidlige stadiene av hjerte utvikling. Her beskriver vi en robust og reproduserbar metode for å co-immunfarging av multiple proteiner eller å co-visualisere et fluorescerende protein med immunofluorescent flekker i den embryonale mus hjerte og bruke denne metoden for å analysere utviklings myofibrils, interkalerte plater og costameres. Denne fremgangsmåte kan videre anvendes for å vurdere cardiomyocyte strukturelle endringer forårsaket av mutasjoner som fører til utviklingshjertefeil.
Introduction
Under utvikling, hjerte sammentrekninger begynne snart etter kardiomyocytter migrere til midtlinjen og danner lineære hjerte tube 1,2. Sarcomere er den grunnleggende kontraktile enhet innenfor cardiomyocyte; dette høyt organisert cytoskeletal strukturen inneholder actinfilamenter forankret til Z-platen ved sarcomeric α-actinin (s-α-actinin) og myosin fibre forankret til M linjen (figur 1). Som cardiomyocyte modnes, sarcomeres sammen i serie for å danne myofibrils som strekker seg over cellen. Myofibrils er forankret til endene av cardiomyocyte av interkalert platen, celle-celle junctional struktur som inneholder en overgangs krysset med et delsett av Z-skålelementer som s-α-actinin 3, adherens koplingsproteiner slik som N-cadherin og β catenin, gap junction-proteiner, og desmosomer (figur 1) 4. Langs lengde membran, Z-plater av perifere myofibrils ogsåknytte til cellemembranen via costameres; disse spesialiserte fokale adhesjon tilveiebringe en forankring mellom myofibrillene, plasmamembranen, og ekstracellulær matriks for å gi ytterligere strukturell understøttelse til cardiomyocyte (figur 1) 4. Tidlig i hjertet utvikling, er kardiomyocytter arrangert i fingeraktige utvekster som kalles trabeculae som stikker inn i ventrikkel plass og inneholder relativt modne myofibrils 5. Som hjerte utvikling provenyet, de cardiomyocytes i sub-epikardial region sprer å danne den kompakte hjertemuskelen som består av kammerveggene, men sarcomere og myofibril montering er forsinket sammenlignet med trabecular myocardium 5,6.
Modeller av sarcomere og myofibril montering kommer i stor grad fra immunofluorescence studier på dyrkede kardiomyocytter 7-10, som er grei, men mangler et tredimensjonalt miljø, blodstrøm, og kontakter med andre hjertecelles stede in vivo. Høyoppløselige strukturelle studier med immunfluorescens i mus embryonale hjerte er teknisk utfordrende, og få studier har utforsket fremveksten av interkalerte plater og costameres under musen hjerte utvikling. Den adherens krysset protein β catenin ser ut til å lokalisere til interkalerte plater av embryonale dag (E) 17.5 11, lokaliserer N-cadherin til lineære strukturer som kan representere interkalerte plater av E18.5 12 versus postnatal dag 0 13, og costameres er påvist på E18.5 14, men disse proteinene vise diffus og mer sammenhengende membran fordeling på tidligere utviklings tidspunkter 11-13.
Her beskriver vi en enkel og reproduserbar metode for farging og fluorescens mikroskopi av seksjonert mus embryonale hjerter som gjør det mulig for detaljert analyse av myofibril og cardiomyocyte utvikling, herunder fremveksten av intercalated-plater så tidlig som E12.5 og gryende costameres på E16.5. Denne protokollen kan være nyttig for undersøkelser av virkningene av mutasjoner på sarcomere dannelse samt myofibril og cardiomyocyte modning.
Protocol
MERK: Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av UCSF Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Kryopreservering og Fiksering av Embryonale Mouse Hearts.
1.1) Snap-frysing embryonale hjerter
- Fyll en 3,5 cm petriskål og 7 mm cryomolds med Optimal Cutting Temperature (OCT) medium (se Materialer Table). I en kjemisk hette, kjøle 2-methylbutane i flytende nitrogen.
- Dispenser 30 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i 10 cm petriskåler, 10 ml PBS inn i 3,5 cm petriskåler, og plassere alle petriskåler på is. Forberede en 10 cm tallerken og flere 3,5 cm retter per gravide mus.
- Isolere embryoer som tidligere beskrevet 15, disseksjon utfører i iskald PBS.
- Kort, avlive den gravide kvinne å bruke CO 2 narkose og halshugging.
- Lage et snitt i buken, dissekere ut livmoren ved å kutte fartøyene along den indre krumning av livmoren, og overføre livmoren til en 10 cm petriskål inneholdende iskald PBS.
- Skjær livmoren i mellom hver embryo og overføring til en enkeltperson 3,5 cm petriskål inneholder iskald PBS. Isolere hver embryo som beskrevet 15.
- Åpne perikard hulrom ved hjelp av fin pinsett, fjerner hjerte bort fra lungene og blodårer ved å kutte i aorta, vena cava inferior, og lungevenene, og overføre til den 3,5 cm petriskål inneholder oktober
- La hjertet likevekt i oktober i flere sekunder, og deretter overføre hjertet inn i 7 mm mold inneholder oktober Orientere den fremre veggen av hjertet til bunnen av formen.
- Forsiktig plassere formen i flytende nitrogen kjølte 2-methylbutane. Pass på å ikke tillate to-methylbutane væske å røre OCT eller hjerte. Fryse til OCT lyser hvitt, deretter overføre formen til en isbøtte med tørris. Gå videre til neste embryo.
- Wrap cryomolds i folie og oppbevares ved -80 ° C til de er klare for cryosectioning.
1.2) Alternativ: Paraformaldehyde (PFA) fikse, kryobeskyttende, og oktober embedding embryonale hjerter
- Fylle brønnene til en 12-brønners vevskulturplate med 4% PFA i 1 x PBS.
- Dissekere ut de embryonale hjerter som beskrevet i 1.1.3. Plasser hvert hjerte i en brønn som inneholder 4% PFA og fikse ved 4 ° CO / N.
- Kryobeskyttelse: ved hjelp av en plastoverføring pipette, bevege hvert hjerte til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 1,5 ml 15% sukrose i PBS og forsiktig omrøre ved 4 ° C inntil hjertet synker til bunnen av røret (flere timer til O / N ). Overfør hver hjertet til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 1,5 ml av 30% sukrose i PBS og forsiktig omrøre ved 4 ° C igjen til hjertet synker til bunnen av røret (flere timer til O / N).
- Bruk en plast overføring pipette, plasserer cryoprotected hjerte i oktober og la det stabili flere minutter for å fjerne overflødig sukrose, deretter overføre hjertet inn i 7 mm mold inneholder oktober Orientere den fremre veggen av hjertet til bunnen av formen.
- Fryse hjertet i oktober ved å plassere formen i enten flytende nitrogen kjølte 2-methylbutane eller tørris.
- Vikle cryomolds i folie og oppbevares ved -80 ° C til de er klare for cryosectioning.
2. Cryosectioning
- Sett kryostat temperaturen til -17 ° C.
- Sted cryomolds inn kryostaten kammeret og likevekt ved temperatur i 15-20 min.
- Snu cryomold og bruke milde press for å fordrive den hjerteblokk fra formen. Orientere den fremre veggen av hjertet til toppen av den støpte blokk vev.
- Plasser en stor dråpe oktober på chucken, og monter hjerteblokk på OCT slipp for å fryse fast i chucken. Hold orientering slik at den fremre vegg av hjertet er lengst fra chucken.
- Laste chuck og monterte hankunst blokken på kryostat objekt holderen. Juster slik at vinkelen av bladet er 3-5 ° i forhold til prøven.
- Samle 10 mikrometer seksjoner over på objektglass som har vært behandlet med et positivt ladet belegg (se Materialer Table). La det tørke helt før lagring ved -80 ° C.
3. Immunfluorescens
- For snap-frosne seksjoner, fikse og permeabilize vev i aceton i 10 min i et avtrekksskap ved RT.
- For snap-frosne og PFA-faste seksjoner, inkuber i PBS-0,1% Triton X-100 for 20 min å fjerne oktober og til permeabilize PFA-faste seksjoner.
- Blokker i 45 minutter i blokkeringsbuffer 1x, fortynnet i PBS.
- Ved hjelp av et primært antistoff generert i mus, inkuberes i esel eller geit-anti-mus IgG (H + L) enverdig Fab-fragment fortynnet 1: 100 i PBS-0,1% Tween 20 i 45 minutter ved romtemperatur (se diskusjon).
- Inkubasjon i primært antistoff eller antistoff fortynnet i 1x blokkeringsbuffer i 2 timer ved RT ellerO / N ved 4 ° C (se tabell av materiell / utstyr for spesifikke fortynninger).
- Vask seksjoner i 1 x PBS tre ganger i 10 minutter ved RT.
- Inkuber i Alexa Fluor-konjugert sekundært antistoff fortynnet 1: 500 i blokkeringsbuffer i 2 timer ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- Vask seksjoner i 1 x PBS tre ganger i 10 minutter ved RT, beskyttet mot lys.
- Valgfritt: Inkuber i Hoechst fargestoff fortynnet 1: 2000 i PBS ved RT (beskyttet mot lys) til å merke kjerner, og skyll med PBS.
- Post-fix merket seksjoner i 1% PFA for 1 min ved RT.
- Mount glir i anti-fade medium (med DAPI hvis kjerner ikke allerede er merket) ved å plassere to dråper medium på hver ende av raset og deretter dekke med et dekkglass. Seal Dekk med neglelakk. Lagres beskyttet mot lys ved 4 ° C inntil de er klare til bildet.
4. Confocal Imaging og bildeanalyse
- Slå på de riktige laser bølgelengder, kamera og konfokal mikroskop incInkl scenen mover og z motor. Start bildeprogram. Bruk 405, 488, og 561 laserbølgelengder for avbilding Hoechst-, Alexa 488, og Alexa 568-fargete snitt henholdsvis.
MERK: Se Materialer Table for våre maskinvare- og programvarespesifikasjoner. - Monter kontroll lysbilde (dekk ned for en invertert mikroskop) på lysbildet scenen.
- Bruke 4X objektiv (se Materialer Table), finner prøven og område av interesse. Ta bildet skal brukes som et kart når avbildning ved høy forstørrelse.
- Ta av dekselet, gjør minimale justeringer til lysbilde scenen. Bytt til 60x oljeneddyppingsobjektivet (se Materialer Table), plasserer en liten dråpe olje på målet, og erstatte lysbildet (dekk ned) på lysbildet scenen.
- Finn prøve igjen. Sett lasereffekten, eksponeringstid, og binning til de ønskede nivåer for hver kanal.
MERK: Vi bruker vanligvis laser styrke på 0,8, kamera eksponeringstid på 100 ms, og binning av 2 (see Materialer Table for maskinvare og programvare); optimale innstillinger må bestemmes empirisk for hvert forsøk.- Når optimale innstillinger er bestemt, kan du bruke de samme innstillingene for alle vevsdelene i forsøket. Bruk intensitet histogrammet til å merke seg den optimale intensiteten for hver kanal (denne informasjonen vil bli brukt til analyse).
- Generere az stabel etter oppkjøps funksjon: velg de riktige laser kanaler, velger de øvre og nedre grense for z stabelen. Velge a-stabel trinnstørrelse som er halvparten av verdien av den optiske skivetykkelse gitt av programvaren. Klikk "Kjør" for å samle bildene.
- Bruk Fiji 16 eller et tilsvarende program for bildeanalyse. Innenfor Fiji, åpner z stabelen fil med Custom fargemodus og kanalene delt inn i egne vinduer. Åpne "Juster lysstyrke / kontrast" verktøy fra bilde nedtrekksmenyen; i hver kanal, set optimal histogram intensiteten fastsatt i 4.5.1. Bruk disse kanalklasser for alle z stabler blir analysert.
- Fusjonere de enkelte kanalene i en enkelt sammensatt bilde ved hjelp av bilde-> Color nedtrekksmenyen.
- Lag en flatet z stabel fra det sammensatte bildet ved hjelp av bilde-> Stacks-> z prosjektet menyen. Dette bildet vil bli betydelig lysere enn 3D-bildet; justere histogram intensiteten for kontrollutvalget å unngå oversaturation, og bruke de samme innstillingene til den eksperimentelle flatet z stabelen.
- For å generere et 3D-bilde, først bruke bilde-> Stacks-> 3D prosjekt meny 17. Velge enten x-aksen eller Y-aksen av rotasjonen. Sett stykket avstand som det samme antall mikron som Z stabelen trinnstørrelsen. Velg ønsket total rotasjon og angi rotasjonsvinkel tilvekst til 1. Deretter åpne bilde J 3D Viewer fra Plugins nedtrekksmenyen. Velg det sammensatte bildet som genereres i 4.8, display som Volume, og sette Reprøvetaking faktor til 1 eller 2.
Representative Results
Figurene 2 til 6 viser typiske resultater for co-farging av ulike proteiner i en snap-frosset og aceton-fast hjerte. Antistoffet mot s-α-actinin reproduserbart merket Z-plater og interkalerte plater med høy spesifisitet og minimal bakgrunns (figurene 2A, 3A, 4A, 5A, 6A og 6C); Figur 6 demonstrerer at anti-mus IgG (H + L) enverdig Fab-fragment effektivt blokkerer endogene muse-IgG-binding av anti-mus sekundære antistoffer. Antistoffet mot adherens krysset protein β catenin bundet membranen av både cardiomyocytes og ikke-cardiomyocyte celler, og samlokalisering med s-α-actinin skjedde i antatte interkalerte plater på E16.5 (figur 2C og D), som forventet fra β catenin fargemønster i voksen hjerte 18. βEn inte immunfluorescens i den embryonale hjertet er spesielt utfordrende og ofte ikke klarer å identifisere fokale voksn 14, men β1 inte flekker i disse studiene avslørte signal med samme periodisitet som s-α-actinin-merket Z-plater, som kan gjenspeile begynnende costameres forming på E16.5 (Figur 3D).
På E12.5, s-α-actinin og tropomyosin (sarcomere tynne filament protein) immunfluorescens avslørte en fargemønster med vanlig periodisitet i trabekulære kardiomyocytter konsistente med modne myofibrils i disse cellene (4A og 5A for s-α-actinin; 4B for tropomyosin). N-cadherin flekker i trabekulære cardiomyocytes på E12.5 hjerter tendens til colocalize med områder med intens s-α-actinin flekker (Figur 5B - D og Figur 6A - C) muligens representerer interkalerte plater. Ikontrast til trabekulære myocytes, s-α-actinin i kompakt sonen var mer punktformet enn lineær, og tropomyosin farging var diffus snarere enn lineær (Figur 4A og 4B). Dermed kan sarcomere montering oppstå senere i kompakt i forhold til trabecular myokard. Videre differensial mønstre av s-α-actinin og tropomyosin i den kompakte sone foreslå at s-α-actinin organiserer inn puncta og umodne Z-plater tidlig, mens tropomyosin innlemmelse i den tynne filament kan være en senere hendelse i myofibril montering.
Figur 7, Movie 1, og Movie 2 viser typiske resultater fra en PFA-fiksert E12.5 embryonale hjerte. I disse eksempler ble en LifeAct-RFPruby transgene embryo brukes for avbildning; den LifeAct-RFPruby transgen 19 etiketter trådformede aktin men krever PFA fiksering. Z-plater som er merket med s-α-actinin var lett å visualisere i de fleste områder, men signal-til-støy-forholdet var Decré ased forhold til snap-frosne hjerte seksjoner (figur 7A); dette signalet var typisk for s-α-actinin immunfluorescens i PFA-fiksert vev, der epitoper kan bli maskert av protein kryssbindinger. Figur 7B viser co-visualisering av trådformede aktin og immunolabeled s-α-actinin innenfor myofibrils (pilspisser) og trådformede aktin innen endokardiale celler som grenser til trabekulære myocytes (piler). Tredimensjonalt bilde gjenoppbygging avslørt flere detaljer: individuelle cardiomyocytes ble lettere skjelnet, myofibrils innenfor en cardiomyocyte ble omtrent parallelt med hverandre, men individuelle cardiomyocytes ble orientert på varierende vinkler til hverandre (figur 7C og D, Movie 1, og Movie 2 ). Den tett tilnærming mellom endokardiale celler og cardiomyocytes ble bedre verdsatt i de tre-dimensjonale visninger i tillegg.
">
Figur 1. cardiomyocyte sarcomeres, interkalerte plater og costameres. The Z-disc forankrer aktin filamenter, mens M linje forankrer myosin fibre, som overlapper de aktin filamenter. Sarcomere består av en Z-disc - M linje - Z-disc enhet. Flere sarcomeres i serien skaper en myofibril. Den laterale enden av myofibril setter inn i tverr grensen av cardiomyocyte på en spesialisert celle-celle junctional struktur kalt Pilgrim plate. Perifere myofibrils koble til langsgående cardiomyocyte plasmamembran via costameres, som danner fokale sammenvoksninger med den ekstracellulære matrise mellom kardiomyocytter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
pload / 52644 / 52644fig2.jpg "/>
Figur 2. s- α -actinin og β catenin immunfluorescens på embryonale dag 16.5. Hjertet ble skåret ut, snap frosset, cryosectioned, aceton fiksert, og immunostained bruker (A) musemonoklonalt klone EA53 antistoff mot s-α-actinin, som bilder merket cardiomyocyte Z-plate og interkalerte plater, og (B) kanin polycloncal antistoff mot adherens krysset protein β catenin. (C) Sammenslåtte viser s-α-actinin og β catenin farging. (D) Forstørret område av interesse fra panel C ; stjernetegn mark antatt interkalerte plater med samlokalisering av s-α-actinin og β catenin. Bildene ble hentet fra det perifere venstre ventrikkel vegg eller kompakt myokard, med epikardial lag øverst til venstre av paneler AC. Intensitet histogram visningsområde 460-1600 (ut of mulig 0-65535) for både s-α-actinin / 488 nm og β catenin / 561 nm laser kanaler. Skala bar 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. s- α -actinin og β en inte immunfluorescens på embryonale dag 16.5. Hjertet ble skåret ut, snap frosset, cryosectioned, aceton fiksert, og immunostained bruker (A) musemonoklonalt klone EA53 antistoff mot s-α-actinin og (B) geit polyklonalt antistoff mot fokal adhesjon protein β1 integrin. (C) fusjonerte bilder viser β1 integrin i cardiomyocyte så vel som ikke-cardiomyocyte celler. Noter både diffus ogpunctate β1 inte signal i kardiomyocytter (D) Forstørret område av interesse fra panel C. Merk punktat, periodisk β1 inte flekker (piler) med periodisitet lignende til nærliggende s-α-actinin-flekker i Z-plater.; disse strukturene kan representere costameres. Bildene ble innhentet fra venstre ventrikkel kompakt myokard. Intensitet histogram visningsområde 460-1200 (av mulig 0-65535) for s-α-actinin / 488 nm laser kanal og 460-600 for β1 inte / 561 nm laser kanal. Skala bar 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. s- α -actinin og tropomyosin immunfluorescens på embryonale dag 12.5: myofibril organisasjon i trabekulært og kompakt myokardium. Hjerter fra kull embryoer ble skåret ut, hurtigfrosset, cryosectioned, aceton-fikserte og immunofarget anvendelse av (A), muse-monoklonalt antistoff mot klon EA53 s-α-actinin og (B) mus monoklonalt antistoff mot myofibrillene tynne filament protein tropomyosin (utviklingsstudier Hybridoma Bank CH1). Trabekulær (piler) og kompakt myokard (pilspisser) er indikert. Note lineær s-α-actinin farging med vanlig periodisitet i det trabeklære myokard, sammenlignet med en rekke fargemønstre inkludert puncta samt lineær farging i det kompakte laget (A). Merk også lineær tropomyosin farging med vanlig periodisitet i trabecular myocardium men mer diffuse flekker i kompakt myokard. Intensitet histogram visningsområde 460-1,400 (av mulig 0-65535) for s-α-actinin kanal og 460-1,000 for tropomyosin kanal. Skala bar 10 mikrometer."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. s- α -actinin og N-cadherin immunfluorescens på embryonale dag 12.5.: Myofibrils og interkalerte plater i trabekulære kardiomyocytter Hjertet ble skåret ut, snap frosset, cryosectioned, aceton fiksert, og immunostained bruker (A) musemonoklonalt klone EA53 antistoff mot s-α-actinin og (B) kanin-polyklonalt antistoff mot fokal adhesjon protein N-cadherin. 0,2 mikrometer optiske skiver ble samlet som az stabelen, og z stabler ble flatet å generere bildene. (C) fusjonerte flate stabler viser både N-cadherin og s-α-actinin flekker innenfor trabekulære cardiomyocytes som well som atomkjerner merket med Hoechst fargestoff (D) Forstørrede område av interesse fra panel C.; stjernene markere interkalerte plater med samlokalisering av s-α-actinin og N-cadherin. Intensitet histogram visningsområde 470-1,200 (av mulig 0-65535) for Hoechst / 405 nm laser kanal og 470-2,000 for både s-α-actinin / 488 nm og N-cadherin / 561 nm laser kanaler. Skala bar 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Anti-mus IgG (H + L) enverdig Fab-fragment effektivt blokkerer endogene muse-IgG-binding av anti-mus sekundære antistoffer. Den E12.5 embryoniske hjerte ble skåret ut, hurtigfrosset, cryosectioned, aceton-fikserte og immunostained.
Figur 7. s- α -actinin og aktin organisasjon i trabecular cardiomyocytes på embryodag 12,5. Den LifeAct-RFPruby transgen muselinje ble brukt for å visualisere trådformede aktin 19, mens mus monoklonalt antistoff mot klon EA53 s-α-actinin ble brukt til å merke Z-plater og interkalerte plater. Embryoene ble PFA-fiksert. 0,2 mikrometer optiske skiver ble samlet som az stack (A) Flatet z stabel viser at s-α-actinin flekker var mer diffus i PFA-fiksert vev enn i snap-frosset og aceton faste seksjoner (Tall 2-5).. (B ) Flatet z stabel viser både trådformede aktin og s-α-actinin. Trådformede aktin fluorescens lokalisert mellom Z-plater innen myofibrils (pilspisser). Trådformede aktin fluorescens ble også sett i endokardiale celler som linje trabecular myocytes (piler). (C) Tre-dimensjonal visning av trabecular kardiomyocytter, sett fra toppen av stabelen. (D) Tre-dimensjonal visning avtrabecular kardiomyocytter, sett fra bunnen av stabelen. Intensitet histogram visningsområde 470-900 (av mulig 0-65535) for både 488 nm laser kanal og for 561 nm laser kanal i A og B; visningsområde 460-800 for begge kanaler i C og D. Scale bar 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1. 360 ° roterende 3D-visning av s- α -actinin og aktin organisasjon i trabekulære cardiomyocytes på embryonale dag 12.5. Bildet stabelen fra figur 6 ble gjengitt i tre dimensjoner ved hjelp av Image J 3D Viewer plugin i Fiji bildeanalyseprogram. Intensitet histogram visningsområde 470-800 (av mulig 0-65535) for både de 488 nm og 561 nm laser kanaler. </ P>
Movie 2. Utvalgte 3D-visning av s- α -actinin og aktin organisasjon i trabekulære cardiomyocytes på embryonale dag 12.5. Bildet stabelen fra figur 6 ble gjengitt i tre dimensjoner ved hjelp av Image J 3D Viewer plugin i Fiji bildeanalyseprogram. Små rotasjoner rundt x-, y- og z-akser viste relativt justert myofibrils innenfor kardiomyocytter men dårlig samsvar mellom de fleste kardiomyocytter. Små rotasjoner også demonstrert tett tilnærming av endokardiale celler som mangler s-α-actinin rundt kardiomyocytter. Intensitet histogram visningsområde 470-800 (av mulig 0-65535) for både 488 nm og 561 nm laser kanaler.
Discussion
Den optimale vev fiksering teknikk og fortynning må bestemmes empirisk for hvert antistoff. I våre hender, snap-frysing er overlegen til PFA fiksering for flere cardiomyocyte antigener, inkludert s-α-actinin, β-catenin, β1-inte, tropomyosin, Talin (ikke vist) og N-cadherin; I motsetning til dette, gir PFA fiksering overlegne resultater for fokal adhesjonskinase (ikke vist). Proteintverrbindinger som dannes ved PFA kan maskere epitoper og begrense antistoffbinding; antigen gjenfinning kan være nødvendig i slike tilfeller, og metoder for antigen gjenfinning kan finnes andre steder 20. PFA konsentrasjon eller lengden av fiksering kan reduseres for å redusere epitop maskering, med optimale forhold empirisk bestemt for hvert antistoff, og ved hvert utviklingsstadiet. Passende negative kontroller bør brukes for å karakterisere en ny antistoff eller hjerte mutant, inkludert pre-immune serum som den primære antistoff kontroll og en "ingen primær antistoff" control. Bruk av knockout-mus er en ideell negativ kontroll, men tidlig dødelighet forhindrer deres anvendelse for mange av genprodukter studert her.
Bruk av tilstrekkelige volumer til helt senk eksperimentelle og slides i samme immunfluorescens blokkering, antistoff, og vaskeløsninger var viktig som var milde rocking av lysbilder under inkubasjon for å sikre ensartet eksponering av seksjonene til løsninger. Denne tilnærmingen minimert teknisk variasjon i farging mellom seksjoner og lysbilder i et eksperiment. Når kostnadene begrenser løsning volumet antistoff, bruke en Pap penn for å begrense flyten av løsninger utover vevsdelene og holde lysbilder i en fuktet kammer under lange inkubasjonene. Dersom et monoklonalt muse primært antistoff - og derfor en anti-muse-sekundært antistoff - blir brukt, vil en andre blokkerende trinn for å dekke endogene mus immunoglobuliner være nødvendig (trinn 3.4) for å redusere ikke-spesifikk bakgrunnssignal.
Passende mikroskopi og bildebehandling teknikker er avgjørende for å oppnå biologisk nøyaktig informasjon 21. Intensiteten Histogrammet indikerer fordelingen av bildepunkter ved hver intensitetsnivå (0-65535 nivåer for et 16-bits bilde) for hver farge. Bakgrunn, kan lysstyrke og kontrast justeres ved å sette en intensitet visningsområde som flankerer histogrammet topp; fatte gyldige sammenligninger mellom forholdene, må de samme innstillingene mellom kontroll og eksperimentelle forhold brukes.
Denne protokollen gir en pålitelig metode for å analysere cardiomyocyte modning og utvikling i den innfødte embryonale mus hjerte. Mens immunfluorescens av cardiomyocyte-spesifikke proteiner blir ofte brukt til å markere kardiomyocytter under utvikling, er det få studier anvende teknikker som gjør det mulig med høy oppløsning analyse av myofibril struktur og fremveksten av interkalerte plater og costameres 12-14,22,23. Denne teknikken kan brukes for in vIvo vurdering av mutasjoner som forårsaker utviklingshjertefeil, som et middel til å fange opp endringer i cardiomyocyte modning som kan kaste lys over mekanismene for strukturelle misdannelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
| Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
| 2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
| Acetone | Sigma | 179124 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS. |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
| Anti-s-α-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-βcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
| Anti-β1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
| Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
| Clara Interline CCD camera | Andor | ||
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
| CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
| CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
| CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
| NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
| Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Risebro, C. A., Riley, P. R.
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation research. 92, 133-135 (2003).
- Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc. Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).
- Kastner, P., et al. Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes. Development. 124, 4749-4758 (1997).
- Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC). American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).
- Kim, Y. Y., et al. Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture. Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).
- Lu, M. H., et al. The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes. The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).
- Schultheiss, T., et al. Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils. The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).
- Samarel, A. M. Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).
- Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).
- Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. N-RAP expression during mouse heart development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).
- Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart. Developmental biology. 289, 430-441 (2006).
- Whitman, S. A., et al. Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle. Circulation research. 109, 262-271 (2011).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC. 11, 274 (2010).
- Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis. Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nature. 7, 168-169 (2010).
- Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).
- Risebro, C. A., et al. Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart. Development. 136, 495-505 (2009).
- Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments. Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).
