मानव स्तन कैंसर के ऊतकों और सेल लाइनों से Mammosphere गठन परख
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
स्वस्थ ऊतकों, कई रक्त और ठोस कैंसर के लिए इसी प्रकार अब और अधिक विभेदित संतान को जन्म दे रही है, जबकि स्वयं को नवीनीकृत कि स्टेम तरह के कैंसर की कोशिकाओं का एक सबसेट के साथ, पदानुक्रम का आयोजन किया जा लगा रहे हैं। समझ और बढ़ाया chemo- और गैर स्टेम ट्यूमर थोक की तुलना में रेडियो-प्रतिरोध के अधिकारी हो सकता है, जो स्तन कैंसर में इन कैंसर स्टेम कोशिकाओं को निशाना, एक महत्वपूर्ण अनुसंधान के क्षेत्र बन गया है। Mammosphere परख भी व्यापक रूप से पूर्वव्यापी sphere- की पहचान करने की क्षमता के लिए इस्तेमाल किया हो गया है: CD44, CD24, और ALDH गतिविधि सहित मार्करों भावी immunocompromised चूहों में प्रत्यारोपित बढ़ाया जब tumorigenicity प्रदर्शित कि कोशिकाओं को अलग करने के लिए छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है एकल स्टेम सेल की तरह क्लोन से विकसित कोशिकाओं है कि बनाने। यहाँ हम सेल लाइनों या प्राथमिक रोगी के नमूने, उनके passaging, और क्षेत्र च अनुमान लगाने के लिए गणना से mammospheres की उचित संवर्धन के लिए दृष्टिकोण की रूपरेखा तैयारorming दक्षता (SFE)। पहले हम उचित योजना और mammosphere प्रयोगों की व्याख्या में महत्वपूर्ण विचार और नुकसान पर चर्चा की।
Introduction
स्टेम तरह के कैंसर स्टेम कोशिकाओं की अध्यक्षता में ट्यूमर सेल प्रजातियों के अस्तित्व को बहुत ट्यूमर विविधता के बारे में हमारी समझ के लिए जोड़ा गया है। ट्यूमर में कुछ प्ररूपी विविधता आनुवंशिक रूप से अलग क्लोन के प्रतिरूप परिणाम से पैदा करता है, एक बड़ा घटक epigenetic मतभेद से परिणाम के लिए प्रकट होता है: कैंसर की कोशिकाओं को विशिष्ट जीन की सक्रियता या दमन के माध्यम से स्टेम, पूर्वज, और विभेदित राज्यों के बीच (reversibly कभी कभी) संक्रमण कर सकते अभिव्यक्ति कार्यक्रमों 1-3। यह वर्तमान में modulatory कारकों पहुंचाने कैंसर, स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं पड़ोसी से पैराक्राइन संकेतन के साथ संयोजन के रूप में अपने परिणामी autocrine संकेतन के साथ एक सेल में व्यक्त की जा रही जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम को दर्शाती है, सेल आंतरिक या बाह्य कारकों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं और इस तरह की डिग्री के रूप में microenviromental शर्तों हाइपोक्सिया 2,4,5।
अभिनव वंश अनुरेखण दृष्टिकोण यद्यपिउनके इन विवो आला 6 में ख्यात कैंसर स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने की हमारी क्षमता आगे बढ़ रहे हैं – 8, क्षेत्र के गठन assays के कम से कम इस्तेमाल किया परख शर्तों के तहत, स्टेम कोशिकाओं की तरह व्यवहार करने के लिए स्तन कैंसर की कोशिकाओं को 'संभावित अनुमान लगाने के लिए एक लोकप्रिय और सुविधाजनक दृष्टिकोण रहते हैं। यह अक्सर करने के लिए और अधिक mesenchymal- और उपकला अनुरूप करने का प्रस्ताव किया गया है कि झिल्ली मार्कर CD44 और CD24 9, और एंजाइम ALDH (एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज) की गतिविधि का स्तर 10, मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति के द्वारा, सफ़ाई कैंसर स्टेम कोशिकाओं के लिए पूर्वव्यापी के तरीकों के साथ प्रयोग किया जाता है की तरह कैंसर स्टेम कोशिकाओं को क्रमश: 11। क्षेत्र के गठन के दृष्टिकोण पहले उपकला वृद्धि कारक (EGF) 12 के अलावा के साथ गैर-पक्षपाती, सीरम मुक्त शर्तों में एकल क्लोन से ख्यात स्टेम कोशिकाओं के विकास को सक्षम करने, neurosphere परख के रूप में विकसित किया गया था, बाद में उपयोगी सामान्य और कैंसर के लिए लागू किया जा रहा है स्तन के ऊतकों।
<p claएस एस = "jove_content"> क्षेत्र के गठन संस्थापक सेल की पहचान, और इस क्षेत्र में बड़े पैमाने पर ऊपर बना मिश्रित प्रकार की कोशिकाओं, mammo-, या assays के गठन के अन्य क्षेत्र से बनाया जा सकता है कि अनुमान के लिए प्रासंगिक हैं। सोचा था कि लंबे समय तक मौन हड्डी फाइड स्टेम सेल, विवो में सक्रियण एहसान होगा कि कारकों के सटीक संयोजन का अनुभव नहीं होगा, G0 चरण में आराम करने के लिए। mammosphere परख बजाय mitotic विभाजन के लिए तैयार हैं या पहले से ही 13 से विभाजित या तो कोशिकाओं के विकास को सक्षम बनाता है। ये पूर्वज, नहीं वास्तव में एक मौन सेल हालांकि, परख में इस्तेमाल EGF और बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) mitogens साथ proliferates कि सेल मंच हो सकता है। फिर भी, वे सक्रिय स्टेम सेल जुड़े संकेतन की एक सीमा के 14 रास्ते होते हैं। इसके अलावा, उनके गठन की दर माउस xenografts 2,15,16 में सीमित कमजोर पड़ने assays में अपनी शक्ति द्वारा मापा वे जब से लिया गया ऊतक के tumorigenicity से संबंधित है </ Sup>।यहाँ हम एकल कोशिकाओं को अलग और मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों और स्तन ट्यूमर के नैदानिक नमूनों दोनों से प्राथमिक mammospheres उत्पन्न करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम यह भी आत्म नवीकरण का आकलन करने के लिए प्राथमिक mammospheres के धारावाहिक मार्ग प्रदर्शन करने के लिए कैसे, और क्षेत्र के विभिन्न बोने घनत्व भर तुलना (चित्रा 1 में योजना देखें) की अनुमति देता है कि दक्षता के गठन की गणना करने के लिए कैसे का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राथमिक और माध्यमिक mammospheres के सफल आकलन कोशिकाओं न्यूनतम क्षेत्र एकत्रीकरण के साथ, एकल क्लोन से फार्म mammospheres कि पर्याप्त रूप से कम घनत्व पर चढ़ाया जा रहा है पर निर्भर करता है। हालांकि बहुत कम हैं कि घनत्व ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम हिलेरी क्राफ्ट और सर डगलस मायर्स के लिए विशेष उल्लेख के साथ इंपीरियल बीआरसी, स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय संस्थान, और एक्शन अगेंस्ट कैंसर द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
References
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