Introduction
Bröstcancerceller metastasera till benmärgen innan sjukdomen är detekterbar 1, så snart som små tumörer utvecklas blodkärl 2,3. Den metastatiska processen är snabb men ineffektiv. Celler in i nya blodkärl snabbt på miljontals per dag 4 men få överlever resan till avlägsna organ 5. Trots vissa mikrometastaser överleva i benet och kan hittas som enskilda celler eller små cellklumpar i benmärgsaspirat från nydiagnostiserade patienter 1. Dessa celler motstå adjuvant kemoterapi, som administreras för själva syftet att eliminera dem 6. Detta motstånd är utrustad, i huvudsak genom överlevnad signalering initieras av interaktioner med benmärgsmikro 7,8. Mikrometastaser kan hittas i ungefär en tredjedel av kvinnor med lokaliserad bröstcancer och representerar en oberoende indikator på överlevnad vid analys av univariat analys 9. Vissa micrometastases är tillväxt inletts, men återfall mönster beroende på celltyp. Patienter med trippel negativ bröstcancer tenderar att återkomma mellan 1 till 4 år, vilket tyder på dålig kontroll över vilande tillstånd. Andra celltyper, inklusive ER / PR + celler, kan förbli vilande i upp till 20 år, med en stadig, kontinuerlig andelen återfall 10. Även skillnader i dvala genuttryck signaturer mellan ER + och ER bröstcellinjer och tumörer speglar olika dvala potentialer 11, interaktioner med benmärgstroma utgör sannolikt ett betydande bidrag till dvala.
Studiet av dvala in vivo är exceptionellt svårt eftersom mikrometastaser är sällsynta och underlägsna av hematopoetiska celler med mer än 10 6-faldigt. Därför måste relevanta modeller skapas som ger in vitro-data som kan föreslå mekanismer och generera testbara hypoteser in vivo. Ett antal av dvala modeller, inklusive Mathe17,18 och spontana tumör och metastasering modellerna 19, har gett tiska modeller 12,13, in vitro modeller 7,8,14,15, in vivo xenograft-modeller 16, kombinationer av in vitro och xenograft-modeller en inblick i cancercell dvala 20 . Var och en av dessa modeller har sina egna begränsningar och är sig själva i första hand användas för att generera hypoteser om molekylär signalering och interaktioner som styr dvala som ska testas mer biologiskt relevanta modeller.
Med det övergripande målet att definiera de molekylära mekanismer dvala, samspelet med mikro som resulterar i cykelstopp, redifferentiering och terapeutiska motstånd och mekanismer som leder till återfall i ER + celler, vi utvecklat en in vitro-modell som ger utvalda relevanta delar av stromala mikromiljö 7. Denna modell, medan relativt gles i komponenter, är tillräckligt robust för att tillåta forskare att ta fram särskilda molekylära mekanismer som påverkar väsentliga funktioner dvala. Dessa experiment generera hypoteser som direkt kan testas in vivo. Modellen bygger på några viktiga faktorer som vi visat sig vara relevant i dvala. De inkluderar användningen av östrogenberoende bröstcancerceller, odling av cellerna vid en klonogen densitet där deras interaktion är i första hand med underlaget och lösliga komponenter i mediet, en fibronektin substrat och närvaron av basisk fibroblasttillväxtfaktor (FGF-2) i mediet.
Vi kännetecknas mekanismer som styr systemet in vitro, inklusive induktionen av cellcykelstopp av FGF-2 21, förmedlas genom TGFp 22, överlevnad signalering genom PI3-kinas 7,8 och ERK 8 och morfogena differentiering till en epitelial fenotyp, vilket berodde på RhoA inaktive, integrin45, 5β1 uppreglering och ligering av stromal fibronektin för överlevnad 7,15 (Figur 1). De cell in vitro cykel effekter av FGF-2 på MCF-7-celler börjar vid koncentrationer åtminstone en log under 10 ng / ml 21,23. Den logiska grunden var baserad på den tidsmässiga kontrollen av FGF-2 expressions reglerar bröst duktal morfogenes, cyklisk expansion och recession i ett antal däggdjurssystem 24-27. Vi visade att FGF-2 inducerar differentiering, inklusive duktal morfogenes i 3D kultur 28, och att FGF-2 uttryck i allmänhet förlorade med malign transformation av humana tumörer 29. Uttrycket av FGR1 förblev intakt i bröst tillfrågade 29 och MCF-7-celler karcinom fortsätter att uttrycka alla 4 FGF-receptorer 30. Inom ramen av dvala, är FGF-2 som exporteras av och kraftigt avsatt på benmärgstroma 31,32 där den fungerar i bevarandet av hematopoietiska stamceller 33. Vi DEMonstrated att FGF-2 inducerar ett vilande tillstånd i ER + bröstcancerceller odlade på fibronektin substrat, också rikligt i märgen, där det inducerar morfogena differentiering 7. I modellen, bröstcancerceller är tillväxt hämmas, inaktivera Rho A genom RhoGap GRAF, redifferentiate till en epitelial fenotyp och återuttryck integriner α5β1 lost med malign progression. De binder fibronektin genom integrin α5β1 och aktivera överlevnad signalerar att göra dem resistenta mot cytostatikabehandling 7,8,15 (Figur 1). Hämning av Rho klass GTPaser har visats tidigare att framkalla en vilande fenotyp 34.
Här kommer vi att beskriva de särskilda förfaranden som möjliggör utredare att fastställa modellen och undersöka specifika molekylära och cellulära mekanismer som styr dvala av ER + bröstcancerceller. I de experiment som presenteras här för att illustrera användningen av modellen, Riktade vi PI3K vägen (Figur 1B) med en AKT-hämmare och en PI3K-hämmare och alla medlemmar i Rho familjen (figur 1B) med en pan-Rho-hämmare och en Rho-kinas (ROCK) hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klonogen analys
- Förbered en enda cellsuspensioner av östrogenberoende bröstcancercellinjer MCF-7 och T47D-celler med användning av de steg som beskrivs nedan
- Aspirera odlingsmedium (DMEM / 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum / glutamin och pen / strep) från en 10 cm vävnadsodlingsskål, som inte är mer än 50% sammanflytande med MCF-7 eller T-47D-celler. Skölj med PBS. Inkubera med trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA löstes i DMEM med hög glukoshalt vid 37 ° C under 1-4 minuter.
- Kontrollera celler vid 1 min intervall enligt ett faskontrastmikroskop för att säkerställa en enkelcellfördelning. Resuspendera cellerna med en 2 ml pipett genom att pipettera upp och ned flera gånger för att störa cell-cellkontakt för att uppnå en nästan oföränderlig, enkelcellstatus.
- Fortsätt att inkubera celler i trypsin vid 37 ° C i upp till 4 minuter om du observerar klumpar av celler efter bara 2 min inkubation. Använd inte dessa celler för klonogeniska studier om de förblir vidhäftande till each andra efter 4 minuter av trypsinization eftersom fel kommer att införas i koloniantalet avkastning.
OBS: Om celler är hopklumpade kommer antalet bildade kolonier återspegla produkten av färre celler än det antal inkuberas. Om celler alltför trypsin, kan deras klonogena potentialen minskas. - Förbered en enkelcellsuspension av 1500 celler / ml odlingsmedium för 24-brunnsplattor, eller mindre, (+ 500 celler / ml, beroende på celltypen eller passagenummer), genom seriespädningar i en huvudröret innehållande hela volymen som behövs för alla variabler i experimentet.
OBS: målet är en slutlig celltäthet av 800 celler / cm 2 (ungefär området 500 till 1100 celler / cm 2). Målet är att ge cirka 100 + 50 kolonier, som medger relativt lätt att räkna, förhindrar trängsel och tillåter tillräcklig kolonier att resultera i betydande statistiska skillnader när kolonier ökas eller minskas genom experimentell perturbationer.
- Inkubera cellerna vid Klonogena Densitet Använda stegen nedan
- Inkubera cellerna i fyrfaldiga brunnar på 24 såväl fibronektinbelagda plattor med en klonogen densitet av 1500 celler / brunn från en master enkelcellsuspension rör av 1500 celler / ml. Finfördela mediet innehållande celler med en 5 ml pipett genom att rita upp 3 ml och utlämning 1 ml medium i varje 2 brunnar.
OBS: fibronektinbelagda plattor bör köpas förbelagt från en kommersiell leverantör. Beläggnings plattor utanför en kvalitetskontrollerad, automatiserad process resulterar i en ojämn yta olämpliga för denna analys. - Blanda suspensionen genom pipettering upp och ned med en 5 ml pipett, upprätta 3 ml cellsuspension och fylla två brunnar med 1 ml vardera. Fyll bara 2 brunnar åt gången från en pipett. Återgå den återstående volymen i pipetten till cellsuspensionen i master röret, återsuspendera cellerna igen genom att pipettera upp och ner och dra upp ytterligare 3 ml för att fylla en annan 2 welLS med en ml vardera.
OBS: Kontinuerlig blandning av master röret är nödvändigt eftersom cellerna kommer kontinuerligt sedimentera. Upprättande tillräcklig volym för att fylla endast 2 brunnar är nödvändigt att tillsätta liknande cellantal till varje brunn eftersom cellerna sedimenterar i pipetten också. - Arbeta snabbt för att fördela de stora volymer av celler eftersom tillåter celler att sitta i suspension vid rumstemperatur och CO2 koncentrationen kommer att modulera sina klonogena potential (opublicerade observationer).
- Optimera den geografiska fördelningen av celler under handlingen att pipettera dem i brunnar för kolonianalyser. Göra det genom att långsamt pipettera suspensionen innehållande den slutliga cellkoncentrationen in i mitten av brunnen. Utsätt inte plattan ytterligare rörelse innan cellerna sjunker till botten. Inte snurra plattan eftersom cirkulär blandning kommer centrifugera effektivt cellerna till omkretsen av de väl skapar höga celldensiteter och oräkneliga konfluenta kolonier på 6 dagar.
OBS: Blanda inte inte är nödvändigt eftersom det är mindre önskvärt än ingen blandning alls efter att införa volymen med cellerna i suspension. Om det är nödvändigt att blanda celler, göra detta genom att förflytta plattan fram och tillbaka i vinkelräta riktningar medan den vilar på en plan yta. - Inkubera cellerna vid 37 ° C 5% CO2 utan media förändring för 6 dagar. Det lilla antalet celler i en brunn efter 6 dagar kommer inte nämnvärt att påverka närings eller cytokin sammansättning eller pH av den ursprungliga mediet.
- Plan tidsförloppet för analysen enligt följande: Inkubera celler på fibronektin belagt substrat på dag 1. Ersätt befintlig medium med 1 ml färskt medium eller nytt medium innehållande FGF-2 10 ng / ml på dag 0. Fläcken celler på dag 6 som nedan 1.4). Genomför några experimentella störningar på dag 3, enligt nedan 1.3).
- Inkubera cellerna i fyrfaldiga brunnar på 24 såväl fibronektinbelagda plattor med en klonogen densitet av 1500 celler / brunn från en master enkelcellsuspension rör av 1500 celler / ml. Finfördela mediet innehållande celler med en 5 ml pipett genom att rita upp 3 ml och utlämning 1 ml medium i varje 2 brunnar.
- Konfigurera Experimentella Störningar av molekylär signalering eller adhesionsmolekyler
- Dag 3, tillsätt 10056, l av en lösning innehållande 10x av den avsedda slutkoncentrationen av den störande medlet till en ml medium i brunnarna. Blanda inte. Fortsätt att inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under ytterligare 3 dagar.
OBS: störa medel kan innehålla en mängd olika inhibitorer och blockerande medel av adhesionsmolekyler, receptorer eller andra ytproteiner, hämmare av intracellulära signalvägar, molekyler, faktorer, kofaktorer eller strukturella proteiner, som kan spela roll i att stödja vilande tillstånd. - Stain kolonier på dag 6, enligt följande.
- Dag 3, tillsätt 10056, l av en lösning innehållande 10x av den avsedda slutkoncentrationen av den störande medlet till en ml medium i brunnarna. Blanda inte. Fortsätt att inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under ytterligare 3 dagar.
- Stain Kolonier
- Fläcken celler efter 6 dagars odling med en nyligen gjorda 0,1% kristallviolett i 2% etanol / 10 mM natriumborat (pH 9,0) -lösning. Aspirera media och lägga till en ml kristallviolett lösning till varje brunn under 20 minuter.
- Tvätta plattorna genom att doppa dem med brunnsöppningarna vända nedåt i en spetsig vinkel i en ishink fyllda med kontinuerligt rinnandevatten i diskhon. Luta plattan till en horisontell vinkel gång under vattnet, väl öppna nedåt, och sedan luta tillbaka till en spetsig vinkel när du tar i en mild flytande rörelse.
- Upprepa nedsänkning två eller tre gånger tills vattnet i botten av brunnarna är inte längre blå. Kraftfulla tvättar kan avlägsna celler eller kolonier som är mindre vidhäftande på grund av experimentella ingripande, med ett betydligt felet i räkna och data.
- Torka plattorna över natten genom att placera dem upp och ner på handdukar på bänk intill deras motsvarande märkta omslag.
- Räkna Kolonier
- Räkna antalet växande och vilande kolonier i varje brunn efter sex dagars inkubation, färgning och torkning. Räkna kolonier optimalt vid 40X förstoring i ett inverterat faskontrastmikroskop. Räkna kolonier av> 30 celler som växer och kolonier av 12 eller färre celler, med den morfologiska utseendet på mycket stora jämfört med att odla celler, stora Expanded cytoplasma med stor cytoplasman till cellkärnan-förhållanden, som visas i figur 1 7,15.
OBS: Kluster av 13-29 celler normalt inte räknas som de inte är mycket vanliga i okomplicerade dvala analyser. De kan räknas om störningar flytta tillväxtpotential antingen växande eller vilande celler. Dessa resultat måste sedan korreleras med biologisk betydelse.
- Räkna antalet växande och vilande kolonier i varje brunn efter sex dagars inkubation, färgning och torkning. Räkna kolonier optimalt vid 40X förstoring i ett inverterat faskontrastmikroskop. Räkna kolonier av> 30 celler som växer och kolonier av 12 eller färre celler, med den morfologiska utseendet på mycket stora jämfört med att odla celler, stora Expanded cytoplasma med stor cytoplasman till cellkärnan-förhållanden, som visas i figur 1 7,15.
2. Klonogena Inkubation för Immunofluorescens Studies
- Justera cellantalet till cirka 7,500-8,000 celler / brunn i 6-brunnsplattor, för att motsvara cellantal / ytarea som är analogt med 24 well experiment.
- Placera en rund, steril, fibronektin-belagda täckglas i varje brunn basen av plattor med 6 brunnar för imaging studier före cell tillägg. Pipet celler i 3 ml volymer till varje brunn 2 brunnar åt gången vid koncentrationer som beskrivs, såsom beskrivits för klonogena försök ovan i 1.2).
- Inkubera cellerna6 dagar, enligt ovan i 1.2.4 och 1.2.5. Lägg störande faktorer på dag 3 vid 10x koncentrationer i 300 pl volymer, som beskrivs i kolonianalysprocedurer i 1.3).
- Fläcken celler på dag 6 med antikroppar till cellvidhäftningsmolekyler, såsom integriner α4, α5, α6, β1, β3, exempelvis fokal vidhäftnings komplexa molekyler FAK, paxillin och vinkulin, exempelvis proteiner involverade i motilitet såsom α-tubulin, exempelvis signaleringsväg medlemmar såsom fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, till exempel, eller något annat protein som är föremål för undersökning med avseende på dess roll i dvala, med användning av standardtekniker för direkt eller indirekt immunofluorescensfärgning.
- Ta bilder med pincett dag 6. Fix i aceton / metanol 1: 1 vid -20 ° C under 20 minuter och lufttorka. En alternativ fixeringsvätska, såsom paraformaldehyd, kan användas, om så är nödvändigt. Permeabilisera celler med 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumcitrat för 2 min feller detektion av intracellulära antigener. Tvätta cellerna med PBS.
- För indirekt immunofluorecence färgning, blockera diabilder för en timme vid rumstemperatur med 5% BSA eller med 10% preimmunserum från arten i vilken den sekundära antikroppen genererades.
- Inkubera över natten vid 4 ° C med primära antikroppar till cellvidhäftningsmolekyler, fokala komplexa molekyler, signaleringsväg medlemmar eller något annat protein som är föremål för undersökning med avseende på dess roll i dvala utspädd till specifika utspädningar rekommenderas av tillverkaren i PBS 0,1% TRITON X -100.
- Tvätta tre gånger med PBS. Inkubera täckglas med fluorofor-konjugerade antikroppar vid rumstemperatur under 2 h. Som ett exempel kan Alexa Fluor 488 åsna-anti-mus-IgG-antikropp användas för att detektera murina monoklonala primära antikroppar. Mount täck cell nedåt på objektglas med hjälp av ett antifade agent med Dapi. Täta omkrets med nagellack.
- För direkt immunfluorescens, genomföra BSAblockering enligt ovan i 2.4.2), inkubera med fluoroforinnehållande konjugerad primär antikropp över natten vid 4 ° C. Tvätta tre gånger med PBS. Inkubera glasen med ett antifade medel och Dapi och tätning med nagellack.
- Locket brickor med aluminiumfolie och förvara vid 4 ° C för avbildning och fotografi som helst upp till flera veckor senare. Se och fotografera celler genom att använda någon fluorescens mikroskopiska bildsystem är utrustade med en kamera på 1,000x förstoring.
- För fibrillärt aktin-färgning, blockera glasen i 1% bovint serumalbumin (BSA) för 30 min och inkubera i BODIPY FL-fallacidin (grön) eller rodamin phalloidin (röd) vid rumstemperatur under 20 minuter. Lägg till ett antifade medel och täta enligt ovan.
3. Klonogena Inkubation för molekylära studier
- Western Blöts
- Inkubera ER + bröstcancerceller MCF-7 eller T47D på klonogena densiteter av 20.000 celler / 60 mm platta och 50.000 celler / 100 mm platta på fibronectenn-belagda plattor vid 37 ° C i 5% CO2.
- Inkubera cellerna vid något högre densitet av 75.000 celler / 100 mm platta för molekylära studier kräver mg belopp för protein från lysat. Använd upp till tio plåtar per försökspunkt för att samla in tillräckligt med protein för molekylära studier med Western blöt eller RNA-isolering för Northern blöts.
- Mobilnummer gel lastning är ett nödvändigt komplement för att jämföra proteinuttryck i vitt skilda stora växande och vilande celler. Samla cellerna genom trypsinizing och räkna en delmängd i en hemocytometer i 0,2% Trypan Blue för framställning av lysat för Western blöts i stället för att skrapa bort celler med en enda kant blad.
- Centrifugera cellerna vid 10000 x g under 2 minuter, avlägsna mediet genom aspiration, tillsätt 200 pl lyseringsbuffert, sonikera cellerna i lysbuffert och bestämma proteinkoncentrationen.
- Beräkna mängden protein per cell genom att dividera proteinutbytet med antalet cellersom genererade detta belopp. Ladda lysatet i varje brunn av separata polyakrylamidgeler som representerar både a) ekvivalenta mängder av protein och b) proteinmängder som representerar motsvarande cellantal. Minst 25 mikrogram protein bör laddas i varje brunn.
OBS: Detta kommer att tillåta jämförelser mellan växande och vilande celler, vilka är signifikant olika i storlek och proteininnehåll (fig 1).
- Flödescytometri
- Samla celler från 100 mm plattor genom trypsinisering, som i 3.1 och analysera med standardfluorescensaktiverad cellsortering (FACS) protokoll med hjälp av primär eller sekundär immunofluorescensfärgning för antingen intracellulära eller extracellulära antigener, som beskrivs i 2.4.
OBS: Demontering celler från vävnadsodlingsplattor genom trypsinering påverkar inte koncentrationen av membranproteiner enligt bestämning genom antikroppsmärkning.
- Samla celler från 100 mm plattor genom trypsinisering, som i 3.1 och analysera med standardfluorescensaktiverad cellsortering (FACS) protokoll med hjälp av primär eller sekundär immunofluorescensfärgning för antingen intracellulära eller extracellulära antigener, som beskrivs i 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experiment utfördes för att rekapitulera analysen. Tidsförloppet för experimentet visas i figur 2A. Celler inkuberas vid klonogena densitet på dag -1, är FGF-2 i färskt medium tillsattes på dag 0 och celler odlas till dag 6 när de är färgade och kolonierna räknas. Eventuella störningar i systemet administreras på dag 3 i 100 pl volymer på 10x slutkoncentrationer önskas. Figur 2B visar det typiska utseendet av växande och vilande kolonier. Växande kolonier innehåller> 30 celler och vilande kolonier innehåller 12 eller färre celler som är många gånger större än att odla celler med stora cytoplasma / nucleus förhållanden. Figur 2C visar en typisk experimentella resultat genomfördes i fyra exemplar. Den dominerande spridningen av celler utan tillsats av FGF-2 representeras av växande kloner medan, i närvaro av FGF-2, den stora majoriteten av kloner är vilande.
INNEHÅLL "> Figur 3 är ett exempel på ett experiment där störande medel tillsattes på dag 3. Figuren representerar dosberoende inhibering av vilande kloner genom hämning av Rho familj GTPases av en pan-Rho-hämmare C3 transferas och en Rho-kinas (ROCK) -hämmare Y27632. Analysen kan bedöma ED50 av tillsatta hämmare på vilande kloner samt växande kloner. I detta experiment undersöktes effekten på växande kloner ej bestämd, eftersom det bara var för att illustrera metoden.Figurerna 4 och 5 visar att analysen kan användas för att bedöma de kombinerade effekterna av inhibitorer på överlevnaden av vilande kloner. Våra tidigare studier har visat att PI3K vägen genomgår en ihållande aktivering i vilande celler i den här modellen och hämning av både PI3K och Akt delvis hämmar överlevnad vilande kloner 7. Här, preliminära iakttagelser visade thatt ospecifik hämning av Rho familj av små GTPases också delvis hämmar överlevnad vilande kloner. Data som presenteras i Figurerna 4 och 5 visar att kombinera inhibering av PI3K och en av dess nedströms effektorer, AKT, med inhibering av Rho familjen med C3 transferas och en ROCK-inhibitor kan nästan helt eliminera överlevnaden av vilande kloner i vissa omständigheter. Vi har tidigare visat att vilande kloner överleva hämning av PI3K men inte av Akt består av celler som inte längre uppvisar vilande fenotypen, utan snarare verkar mesenkymala och bedrövad 7. Celler i vilande kloner i vilka Rho familj har i stort sett hämmas av C3 transferas och ROCK-hämmare förlorar också den typiska vilande utseende, antar fibrolastoid framträdanden och ruggig membran och även visas nödställda (Figur 6). Dessa experiment visar en modell som kan frågas i en mycket broad sätt för att uppnå en förståelse för de faktorer som styr dvala och motstånd mot terapi.
Figur 1: mekanismer som styr vårt in vitro dvala modell (A) Odling och vilande MCF-7 kloner efter 6 dagars inkubation vid klonogen tätheten på fibronektinbelagda plattor med och utan FGF2 10 ng / ml 7 (100 gångers förstoring).. (B) Sammanfattning schema som beskriver de data som FGFR och integrin α5β1 parallella steady state signalering krävs för att aktivera och underhålla dvala 7. FGF-2 uppreglerar cyklinberoende kinashämmare leder till G1 gripande 21, aktiverar ERK 8 och PI3 kinas 7 som initiatesurvival signalering och uppreglera grin α5β1 7, som når stationärt tillstånd efter flera dagar. Dubbla signalerings rakt igenomh FGFR genom PI3K och självständigt genom ligering av grin α5β1 av fibronektin erfordras för aktivering av FAK och membranlokalisering och aktivering av RhoA GAP GRAF 15. Detta resulterar i inaktivering av RhoA och en tillåtande steady state för kortikal ombildning av F-aktin (falloidin-färgade mikrofotografi), epitelial åter differentiering och dvala 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Delar av dvala analysen in vitro (A) Schema i tiden komponenterna i dvala analysen.. Celler inkuberas på fibronektin belagda vävnadsodlingsplattor vid klonogena densitet, vid en maximal densitet av 1500 celler / brunn i en 24 brunnars platta i en incubator vid 37 ° C och 5% CO2 på dag 1. Mediet ersattes på dag 0 med färskt medium eller färskt medium innehållande FGF-2 10 ng / ml och cellerna åter inkuberas. Celler färgades med kristallviolett lösning, som beskrivs, på dag 6. Alla hämmare eller störnings medel tillsätts på dag 3 i 100 pl volymer på 10x önskade koncentrationerna och celler åter ruvade till dag 6. (B) utseende färgade växande och vilande MCF-7 kolonier. Växande kolonier innehåller> 30 celler och vilande kolonier innehåller 12 eller färre celler. Vilande celler är pannkaka formad, många gånger större än att odla celler med stora cytoplasma / nucleus förhållanden. (100 gångers förstoring). (C) Diagram som visar den klonogena potentialen hos 1500 MCF-7 humana bröstcancerceller inkuberade med och utan FGF-2 10 ng / ml på fibronektinbelagda plattor med 24 brunnar. Utan FGF-2, är den dominerande fördelningen av celler som representeras av växande kloner medan i närvaro av FGF- 2 den stora majoriteten av kloner är vilande. Experiment gjordes i fyra exemplar. (Felstaplar är + SD)
Figur 3: Dosberoende inhibering av vilande kloner av Pan-Rho familj hämmare C3 transferas och ROCK-inhibitor Y27632 T-47D-celler inkuberades vid klonogena täthet av 1000 celler per brunn på 24 väl fibronektin-belagda plattor med FGF-2. 10 ng / ml för 6 dagar. Medier, C3 transferas 3 eller 5 ^ g / ml, och ROCK inhibitor Y27632 0,1, 1 eller 10 | ig / ml var på dag 3 och vilande kloner räknades på dag 6. Diagrammet demonstrerar en dosberoende inhibering av fläckade vilande kloner på dag 6. ED 50 C3 var approximativt 3 | ig / ml medan den för ROCK-inhibitor var mellan 1 och 10 | iM i denna analys. Experiment gjordes i fyra exemplar. (Felstaplar är + SD)
Figur 4:. Kombinerade effekterna av pan-Rho familj hämmare C3 med en AKT-hämmare eller med PI3 kinashämmare på överlevnaden av vilande T-47D-kloner T-47D-celler inkuberades vid klonogena täthet av 1000 celler per brunn på 24 brunnar fibronektin -belagda plattor med FGF-2 10 ng / ml under 6 dagar. Media, C3 transferas 5 mikrogram / ml, AKT-hämmare 25 iM och LY294002 20 iM tillsattes var för sig eller i kombination på dag 3 och vilande kloner räknades på dag 6. De kombinerade effekterna av C3 och AKT-hämmare tycks vara additiv på dessa koncentrationer men den kombinerade effekten av C3 och PI3K-hämmare tycks vara synergistisk i dessa experiment på hämning av vilande klon överlevnad. Experiment gjordes i fyra exemplar. (Felstaplar är + SD)
= "Bild 5" src = "/ filer / ftp_upload / 52672 / 52672fig5.jpg" />
Figur 5:. Kombinerade effekterna av ROCK-inhibitor Y27632 med en AKT-hämmare eller med PI3 kinashämmare på överlevnaden av vilande T-47D-kloner T-47D-celler inkuberades vid klonogena täthet av 1000 celler per brunn på 24 väl fibronektin-belagda plattor med FGF-2 10 ng / ml under 6 dagar. Medier, ROCK-inhibitor Y27632 3 | ig / ml, AKT-hämmare 25 pM och LY294002 20 pM tillsattes individuellt eller i kombination på dag 3 och vilande kloner räknades på dag 6. De kombinerade effekterna av Y27632 och AKT-hämmare verkar inte vara tillsats vid dessa koncentrationer, men den kombinerade effekten av Y27632 och PI3K-hämmare verkar vara mer än additiv i dessa experiment på hämning av vilande klon överlevnad. Experiment gjordes i fyra exemplar. (Felstaplar är + SD)
.jpg "/>
Figur 6:. Utseendet på överlevande vilande T-47D-kloner efter behandling med C3 transferas och ROCK-inhibitor Y27632 kolonianalyser etablerades i fyra exemplar på 24 väl fibronektin belagda vävnadsodlingsplattor vid 1000 celler / brunn med FGF-2, såsom beskrivits, inhibitorer sattes på dag 3 vid koncentrationer visade färgades cellerna och fotograferades på dag 6. Celler behandlade med pan-Rho familjen hämmare förlorat de sprids utseende, blev små, dendritiska och verkade bekymrad. (100 gångers förstoring).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår modell består av flera viktiga delar av dvala i benmärgen. Den består av östrogenkänsliga celler, som är den typ som sannolikt kommer att förbli vilande i märgen under längre perioder 10, den består av fibronektin, ett viktigt strukturelement i märgen, FGF-2, en tillväxtfaktor rikligt syntetiseras genom benmärgstroma och tungt deponerad i den extracellulära matrisen hos benmärgen 31,32 och inkubering av celler vid klonogen densitet där deras interaktioner är i första hand med substratet. Medan benmärgens mikromiljö är mycket mer komplicerat, kan detta enkla system byggas upp med så mycket ytterligare komplexitet som krävs för att ställa specifika mekanistiska frågor.
Modellen kan användas för att jämföra vilande med att odla celler i ett antal olika sätt, bland annat cell biologiska tekniker, molekylära tekniker och in vivo-tekniker. Cellulära fenotyper kan analyseras genom re-kloning, motilitetoch invasion studerar 35, icke vidhäftande tumör initiera sfär bildning 36 eller genom funktionella studier för samverkan med mikro användning av specifika blockerande antikroppar eller peptider 7.
Den primära utsignalen från klonogen analys är en numerisk räkning av kolonier, antingen växande eller vilande, som översätts till den växande eller vilande klonogena potentialen hos cellerna. Såsom antyds ovan kan ett stort antal variabler har potentialen att påverka detta utfall, vilka alla måste kontrolleras så strikt som möjligt för att ge reproducerbara resultat. Dessa innefattar källan till celler, totala passagenummer, kryokonservering teknik och kvaliteten på de cellkulturer som var kryokonserverades, antalet passager sedan upptining, sammanflödet av kulturer från vilka de enskilda cellpreparat erhölls, källan och kvalitet fetalt kalvserum, de löptider trypsinization och deras reproducerbarhet, varaktighetav celler kvar vid rumstemperatur, fingerfärdighet pipettering likvärdiga cellantal i varje brunn, den fingerfärdighet eller jämnt fördela celler över hela ytarean av en brunn, antalet gånger en platta avlägsnas från inkubatorn för observation, bland dussintals andra. Förutom att representera allmänt accepterade kontroller vävnadsodling kvalitet, dessa variabler påverkar vilande klonogena potentialen från experiment till experiment. Intra-experimentell variabilitet är typiskt mindre än 8-10%, dock resulterar i procentuella förändringar från experiment experiment som är mycket reproducerbara. Vanligtvis börjar variansen av data för att minska med en direkt korrelation av ökad erfarenhet av försöksledaren med systemet och tiden genomför denna analys.
Genuttryck i vilande och växande celler kan bedömas genom RT PCR, Northern blöt, Western blot, immunoprecipitation / västra och funktionell komplex utfällning / Western, Immunofluorescens eller immunohistokemi, multiplexering av mikrofluidik, Raman-spektroskopi, flödescytometri och andra tekniker. Dessa tekniker kan användas för att bestämma roller specifika receptorer, andra membranproteiner, signalvägar, transkriptionsfaktorer, histon modifierings, organeller och mitokondriella proteiner, metaboliska vägar och energianvändning, spänning och kraft och interaktion med mikro i otaliga sätt på roll av dvala.
Våra tidigare studier har visat signifikanta roller för PI3K vägar i överlevnad vilande kloner 7 samt att upprätthålla den vilande fenotypen med epitelial fördelningen av kortikala aktin 15. Vi visade också att RhoA specifikt, måste inhiberas för att den vilande fenotypen ska aktiveras. Detta är i motsats till de data som presenteras här, där inaktivering av Rho familjen med pan-hämmare minskar överlevnaden av vilande kloner. Thans understryker faran med att använda kemiska inhibitorer att dissekera mekanismer och behovet av att använda genetiska metoder för att hämma eller aktivera specifika vägar. För detta ändamål lånar metod sig till genetisk manipulation av celler, antingen genom permanent transfektion eller transduktion eller genom transient transfektion 15, siRNA eller nanopartiklar. Eftersom analysen är 6 dagar i längd, övergående genuttryck eller störning med det kommer att resultera i betydande fenotypiska effekter på 6 dagar som kan mätas.
Erkänner dess potential för att studera mekanismer för att komma in liksom spännande dvala, vi undersöker för närvarande mekanismer för dessa celler att fly dvala. När du skriver in dvala är dåligt förstådd, är ännu mer svårfångade en förståelse för de mekanismer som styr utgången från vilande tillstånd. Vi har rapporterat preliminära iakttagelser som inflammatoriska svar från skadade stroma kan bidra till återuppvaknande av dorMant MCF-7-celler med hjälp av denna modell 37. Modellen kan appliceras på T-47 celler samt annan ER + bröstcancer cellinje. Medan ER-celler inte blir vilande i beroende av FGF-2, kan det vara möjligt att anpassa metoden till andra typer av cancerceller med olika differentieringsmedel i framtida undersökningar.
Trots att en mycket användbar teknik för att identifiera nyckelmekanism involverad i dvala, är det fortfarande ett in vitro-modell. Däremot kan celler som har genomgått dvala eller in vitro manipulering testas för xenograft tumör bildande kapacitet. Den huvudsakliga potentiella nyttan av systemet, är emellertid identifieringen av mekanismer som kommer att möjliggöra utvecklingen av en hypotes som kan testas i mycket komplexa in vivo dvala modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Med stöd av försvarsdepartementet Grants DAMD17-01-C-0343 och DAMD17-03-1-0524, New Jersey statliga kommissionen för cancerforskning 02-1140-CCR-E0 och Ruth Estrin Goldberg Memorial för cancerforskning (RW)
Acknowledgments
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).
