En billig, skalerbar Behavioral Assay til måling Ethanol Sedation Følsomhed og Rapid Tolerance i<em> Drosophila</em
Summary
Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.
Abstract
Alkohol brug disorder (DKK) er en alvorlig sundhedsmæssig udfordring. På trods af en stor arvelig komponent til AUD har kun få gener blevet utvetydigt impliceret i deres ætiologi. Bananfluen, Drosophila melanogaster, er en kraftfuld model for at udforske molekylære-genetiske mekanismer bag alkoholrelaterede adfærd, og derfor lover godt for at identificere og forstå funktionen af gener, der har indflydelse AUD. Brugen af Drosophila model for disse typer af undersøgelser afhænger af tilgængeligheden af analyser, som pålideligt måler adfærdsmæssige reaktioner på ethanol. Denne rapport beskriver et assay egnet til vurdering af ethanol følsomhed og hurtig tolerance i fluer. Ethanol følsomhed måles i dette assay påvirkes af mængden og koncentrationen af ethanol anvendes en række tidligere rapporterede genetiske manipulationer, og også den tid, fluer er anbragt uden mad umiddelbart før testning. I modsætning hertil ethanol sensitivity målt i denne analyse er ikke påvirket af styrken i flyve håndtering, køn fluerne, og tilskud af vækstmedium med antibiotika eller levende gær. Tre forskellige metoder til kvantificering ethanol følsomhed er beskrevet, der alle fører til væsentlige skelnes ethanol følsomhed resultater. Den skalerbare karakter af denne analyse, kombineret med dens overordnede enkelhed at sætte op og relativt lave omkostninger, gør den velegnet til små og store genetisk analyse af ethanol følsomhed og hurtig tolerance i Drosophila.
Introduction
Alkohol brug disorder (DKK) er et enormt sundhedsproblem i hele verden (revideret i 1). Selvom de mekanismer, der styrer udviklingen af AUD er komplekse, disse lidelser har en stor genetisk komponent (f.eks 2). Den store arvelighed af AUD og de konserverede adfærdsmæssige reaktioner til ethanol på tværs af mange arter (gennemgået i 3,4) har genereret stor interesse i at anvende genetiske modelorganismer at undersøge inddragelse af specifikke gener i ethanol-relateret adfærd mod bedre forstå den molekylære basis for AUD. Bananfluen, Drosophila melanogaster, har vist sig som en førende model organisme for at udforske molekylære-genetiske mekanismer ethanol adfærd (revideret i 3,4). Undersøgelser i fluer har fremhævet roller i flere signalveje i adfærdsmæssige reaktioner på ethanol (revideret i 5). Interessant nok nogle af generne og veje, der påvirker adfærdsmæssige responses til ethanol i fluer har også været impliceret i gnavere ethanol-relateret adfærd og / eller human AUD (fx 6-14). Bevarelsen af mekanismer kørsel ethanol-relaterede adfærd på tværs af arter, kombineret med den suite af genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila modelsystemet, understreger nytten af bananfluen model til undersøgelse genetik adfærdsmæssige reaktioner på ethanol.
Følsomhed 15,16 og tolerance (revideret i 17) til ethanol i mennesker er knyttet til udviklingen af AUD. Begge disse adfærdsmæssige reaktioner på ethanol kan modelleres i fluer via en række forskellige laboratorieanalyser (revideret i 3,4). Alle de flyve assays er kendt af forfatterne er baseret på enten tidsafhængig ethanol-induceret sedation / manglende koordination eller tidsafhængig genrejsning ethanol sedation.
I en tidligere artikel fra vores gruppe på genetik ethanol følsomhed og rAPID tolerance i Drosophila blev en adfærdsmæssig assay baseret på ethanol damp-induceret sedation af fluer brugt 18. Afprøvning i dette assay blev initieret ved at overføre levende voksne fluer uden bedøvelse tømme fødevarer hætteglas, opfange de fluer i hætteglas med en celluloseacetat stik, tilsætning af ethanol til toppen (dvs. ikke-flyve side) af celluloseacetat stikket, og forsegling af hætteglasset med fluer, celluloseacetat stik og ethanol med en silicone prop (se skematisk i fig S3, reference 18). Flere hætteglas repræsenterer forskellige grupper af fluer blev vurderet i parallel, øge throughput af dette assay. Hætteglas fik en anonym kode og eksperimentatorer blev blindet til behandlingsgruppen for at forhindre utilsigtet skævhed i vurderingen af sedation. I et standard eksperiment, fluer i hætteglas blev tappet forsigtigt ved 6 minutters intervaller, og efter en 30 sek opsving blev antallet af sederede fluer i hvert hætteglas talt og converted til procent aktive fluer. Fluer absorberede ethanol damp fra celluloseacetat plug i en tidsafhængig måde, hvilket progressive stigninger i internt ethanol 18 og sedation (jf henvisning 18 og figur 1A og 1B i denne rapport). Sedation i dette assay blev operationelt defineret som fluer (I) stående i fravær af walking eller (ii), der ligger på ryggen, med eller uden flagrende deres vinger. Her er denne ethanol sedation assay beskrevet i detaljer, er yderligere driftsoptimering relevante for at bruge det forudsat, og analysen bruges til at behandle bidrag af fødevarer tilskud optioner på flue sedation følsomhed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enkle assays, reproducerbart mængdebestemme meningsfulde fænotyper er af stor værdi til analyse af adfærd. Den her beskrevne arbejde omhandler adskillige praktiske aspekter af et assay til måling af ethanol sedation følsomhed og hurtig tolerance i Drosophila. Selvom det ikke er fokus i dette arbejde, er adfærdsmæssige analyser lettes ved at bevare miljøet og genetiske baggrund konstant for testpersoner en studiegruppe. Endvidere bør sammenligninger typisk mellem grupper af fluer opdrættet og testet s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were supported by grants from the National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). The authors thank Jill Bettinger for helpful discussions and Jacqueline DeLoyht for technical assistance.
Materials
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A., Reilly, M. T., Lovinger, D. M. . Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. 91, (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Rothenfluh, A., Troutwine, B. R., Ghezzi, A., Atkinson, N. S., Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
