Un ensayo de conducta Barato, escalable para medir etanol Sedación La sensibilidad y la tolerancia rápida en<em> Drosophila</em

Summary

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Abstract

Trastorno por consumo de alcohol (AUD) es un grave problema de salud. A pesar de un gran componente hereditario AUD, algunos genes se han implicado de forma inequívoca en su etiología. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un poderoso modelo para explorar los mecanismos moleculares que subyacen a los comportamientos genéticos relacionados con el alcohol y por lo tanto representa una gran promesa para la identificación y la comprensión de la función de los genes que influyen en AUD. El uso del modelo de Drosophila para estos tipos de estudios depende de la disponibilidad de ensayos que miden de forma fiable respuestas de comportamiento a etanol. Este informe describe un ensayo adecuado para evaluar la sensibilidad de etanol y rápida tolerancia en las moscas. Sensibilidad etanol medido en este ensayo está influenciada por el volumen y la concentración de etanol utilizado, una variedad de manipulaciones genéticas se informó anteriormente, y también la longitud de tiempo que las moscas se alojan sin alimentos inmediatamente antes de la prueba. En contraste, el etanol sensitivity medido en este ensayo no se ve afectada por el vigor de la manipulación de la mosca, el sexo de las moscas, y la suplementación de medio de crecimiento con antibióticos o levaduras vivas. Tres métodos diferentes para cuantificar la sensibilidad de etanol se describen, todo lo cual lleva a los resultados de sensibilidad etanol esencialmente indistinguibles. La naturaleza escalable de este ensayo, junto con su simplicidad general de puesta a punto y relativamente de bajo costo, lo hacen adecuado para el análisis genético pequeña y gran escala de sensibilidad etanol y rápida tolerancia en Drosophila.

Introduction

Trastorno por consumo de alcohol (AUD) es un enorme problema de salud en todo el mundo (revisado en ^1). Aunque los mecanismos que impulsan el desarrollo de AUD son complejos, estos trastornos tienen un componente genético importante (por ejemplo, ^2). La gran heredabilidad de la AUD y las respuestas conductuales conservadas en etanol a través de muchas especies (revisado en ^3,4) han generado un gran interés en el uso de organismos modelo genético para investigar la participación de genes específicos en los comportamientos relacionados con etanol hacia una mejor comprensión de las bases moleculares de AUD. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha convertido en un organismo líder en modelo para explorar los mecanismos moleculares genética de los comportamientos relacionados con etanol (revisado en ^3,4). Los estudios en moscas han puesto de relieve los roles de varias vías de señalización en las respuestas conductuales a etanol (revisado en ^5). Curiosamente, algunos de los genes y las vías que influir respons conductualeses a etanol en las moscas también se han implicado en los comportamientos relacionados con etanol de roedores y / o AUD humano (por ejemplo, ^6-14). La conservación de los mecanismos de los comportamientos relacionados con la conducción de etanol a través de especies, junto con la suite de herramientas genéticas disponibles en el sistema modelo de Drosophila, ponen de relieve la utilidad del modelo de mosca de la fruta para la investigación de la genética de las respuestas de comportamiento a etanol.

Sensibilidad ^15,16 y la tolerancia (revisado en ¹⁷⁾ a etanol en los seres humanos está relacionada con el desarrollo de AUD. Ambas de estas respuestas de comportamiento a etanol puede ser modelado en las moscas a través de una variedad de ensayos de laboratorio (revisado en ^3,4). Todos los ensayos de moscas que se sabe que los autores se basan en cualquiera de tiempo-dependiente inducida por etanol sedación / falta de coordinación o de recuperación en función del tiempo de sedación etanol.

En un artículo anterior de nuestro grupo sobre la genética de la sensibilidad de etanol y rtolerancia apid en Drosophila, se usó un ensayo de comportamiento basados ​​en etanol sedación inducida por vapor de ^moscas-18. Prueba en este ensayo se inició mediante la transferencia de adulto vivo vuela sin anestesia para vaciar viales de alimentos, atrapando las moscas en los viales con un tapón de acetato de celulosa, la adición de etanol a la parte superior (es decir, el lado no-fly) de la bujía de acetato de celulosa, y sellar el vial que contiene moscas, tapón de acetato de celulosa y el etanol con un tapón de silicona (véase el esquema de la Figura S3, referencia ^18). Viales de múltiples que representan los diferentes grupos de moscas fueron evaluados en paralelo, aumentando el rendimiento de este ensayo. Los viales se les dio un código anónimo y experimentadores estaban cegados al grupo de tratamiento para evitar el sesgo no intencional en la evaluación de la sedación. En un experimento estándar, moscas en viales se golpeó suavemente a intervalos de 6 min y, después de una recuperación de 30 segundos, se contó y converte el número de moscas sedados en cada viald para ciento moscas activos. Las moscas absorben vapor de etanol a partir de la clavija de acetato de celulosa de una manera dependiente del tiempo, causando aumentos progresivos en etanol interno ¹⁸ y sedación (referencia cf ¹⁸ y la Figura 1A y 1B en este informe). Sedación en este ensayo se define operacionalmente como moscas (i) de pie en la ausencia de caminar o (ii) que se encuentra en la espalda con o sin batir sus alas. Aquí, este ensayo sedación etanol se describe en detalle, se proporciona una mayor optimización operativa relevante para su uso, y el ensayo se utiliza para tratar la contribución de opciones de administración de suplementos de alimentos sobre la sensibilidad a la sedación mosca.

Protocol

1. Día Antes de Ensayo Recoger moscas en viales de alimentos frescos en grupos de 11 (solo sexo) bajo breve (1-5 min) CO 2. Permitir que las moscas se recuperen O / N en viales de alimentos en un espacio con ambiente controlado (normalmente 25 ° C, humedad relativa del 60%, 12 horas de luz / oscuridad ciclo). Preparar la solución de etanol (s) diluyendo puro (100%) de etanol en (≥18 MΩ) agua purificada hasta una concentración final (s) apropiado para el experimento planea…

Representative Results

Los datos brutos de este ensayo sedación etanol son los números de moscas que son sedados como una función de vapor de etanol tiempo de exposición. Los datos en bruto se convierten a las moscas por ciento activos como una función del tiempo (datos primarios, las figuras 1A, B, D – F). Sensibilidad a la sedación etanol a partir de los datos primarios se puede cuantificar como la sedación Tiempo 50 (ST50), el tiempo requerido para el 50% de las moscas para convertirse en sedado o A…

Discussion

Ensayos sencillos que cuantifican reproducible fenotipos significativos son de gran valor para el análisis del comportamiento. El trabajo que se describe aquí aborda varios aspectos prácticos de un ensayo para medir la sensibilidad sedación etanol y rápida tolerancia en Drosophila. Aunque no es un tema central de este trabajo, análisis de comportamiento son facilitadas por el mantenimiento del medio ambiente y los antecedentes genéticos constante para los sujetos de prueba en un estudio. Además, por lo …

Materials

food vials	VWR	89092-772	narrow
Flugs	Genesee/flystuff.com	49-102	narrow
silicone stopper	Fisher Scientific	09-704-1l	#4
ethanol	Pharmaco-Aaper	111000200	200 proof